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[摘要]目的：探讨PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑修复大鼠坐骨神经缺损的修复效果。方法：32只SD大鼠平均分成4组，无菌条件下切断右侧的坐骨神经，制成10mm长的大鼠坐骨神经缺损模型，A组采用PLGA神经导管连接缺损神经进行修复，B组由内置自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接，C组由内置ADSCs与自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接，D组采用自体神经移植方式。12周后通过对再生神经桥接体的一般观察、HE染色、免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色来评价神经的再生情况；通过肌电图、腓肠肌的HE和Masson染色来评价神经对靶器官的再支配情况。结果：术后12周，各组的神经导管均已降解，切断神经通过神经导管向两端生长。一般观察、肌电图、组织学观察结果均提示PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑组C组的修复效果显著优于内置神经组织碎屑的PLGA神经导管组B组和空导管组A组的修复效果，但仍稍差于自体神经移植组D组。结论：PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织可以比较有效地修复周围神经缺损，为周围神经缺损的修复提供了一种新的方法。
[关键词]周围神经缺损；神经组织碎屑；脂肪干细胞；聚乳酸羟基乙酸；神经导管
[中图分类号]R745 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0060-06
周围神经缺损是临床上常见的疾病，外伤、手术操作、肿瘤切除等均会导致周围神经缺损的发生，对于普通的神经离断损伤可以在无张力的条件下用端端吻合的方法修复。而对于较长节段神经缺损的修复，目前的金标准是自体神经移植，但是自体神经移植具有供区来源有限、二次损伤、供区的感觉功能障碍、供区和受区神经结构和粗细不匹配等缺点。鉴于自体神经移植的诸多限制，组织工程神经导管应运而生，人们早期曾使用空腔静脉导管修复周围神经缺损，后来有学者采用在静脉内填充神经碎屑来修复周围神经缺损，均取得了比较好的修复效果。近年来聚乳酸羟基乙酸（poly-lactic-co-glycolic-acid，PLGA）神经导管以其优越的性能受到学者们的重视且已被广泛应用于各研究中，其性能也得到进一步完善，如对导管进行甲壳素涂层来改善导管的生物学性能；在导管内置入纤维丝改善神经导管的内部空间结构等。有研究发现PLGA材料复合雪旺细胞、细胞生长因子、间充质干细胞或脂肪干细胞（adipose derived stem ceils，ADSCs）后能促进轴突的再生和髓鞘的形成以及神经功能的恢复。本实验设计以PLGA神经导管为支架材料，将自体来源的神经碎屑，复合ADSCs填充到神经导管中，探讨此种联合自体神经组织和ADSCs的具有内部空间结构的神经导管修复周围神经缺损的效果。
1材料和方法
1.1材料与设备：健康成年SD大鼠32只，雌性，体重200～250g（上海斯莱克动物实验有限公司）；5～7d SD乳鼠若干只，体重（16.0±2.1）g（上海斯莱克动物实验有限公司）。
DMEM培养基（Hyclone）、复合胶原酶NB4（Serva，Germany）、胎牛血清（Hyclone，Australia）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.2 5%trypsin-EDTA（Gibco，Canada）、兔抗单克隆neurofilament-H（Millipore，USA）、兔抗S100单克隆抗体（Dako，Denmark）、驴抗兔IgG抗体（Invitrogen，USA）、Masson染色试剂盒（Leagene）、Calcein-AM（上海麦约尔生物技术有限公司）、甲苯胺蓝。PLGA导管材料由东华大学提供。
倒置相差显微镜（Olympus，Japan）、恒温CO2培养箱（Forma Scientific，USA）离心机（Thermo，USA）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）、正置显微镜（Nikon 90i，Japan）、Evos显微镜（Life，USA）、荧光显微镜（Nikon，Japan）、冰冻切片机（Shandon Cryotome FSE，Thermo scientific，British）、Key point多道肌电图仪（Dantec，丹麦）、石蜡切片机（Shandon Finesse 325，Thermo Shandon Ltd.，British）、解剖显微镜（Motic，USA）、显微外科手术器械（上海手术器械厂，中国）。
1.2实验方法
1.2.1 PLGA神经导管的准备：取PLGA神经导管，环氧乙烷消毒，真空包装备用。
1.2.2 ADSCs的取材、培养、观察和鉴定：将5～7d SD乳鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精中浸泡5min后，无菌条件下取其腹股沟皮下脂肪组织，置入培养皿中，向皿中加入含2%FBS的冷PBS洗去血液。将脂肪块剪碎至约1mm3大小，向培养皿中加入0.2%复合胶原酶NB4（用DMEM培养基配制），转移至一次性离心管中，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。每隔5min振荡1次，消化约1.5h，反复吹打约5min，使组织充分分散。以1500rpm、37℃、离心5min，弃去上清，加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，按大约1×103/cm2密度将细胞接种到培养皿中，置于37℃、5%COz培养箱培养。待原代细胞长满至培养皿的80%左右，吸去上清液，PBS漂洗后，加37℃、0.25%trypsin-EDTA消化約1min，轻轻拍打培养皿使细胞从皿底脱离，加入含血清的DMEM培养基终止消化，收集所得细胞，以1500rpm、37℃、离心5min，培养液重悬，按1：2的比例传代接种，置于37℃、5%CO2培养箱继续培养，每48h换液一次，待细胞增殖至覆盖皿底80%时，用同样方法传代，传至第三代，行Calcein-AM荧光染色后镜下进行细胞形态学观察，参照张怡等的实验方法对脂肪干细胞行CD29和CD44细胞流式技术鉴定，并对脂肪干细胞培养备用。 1.2.3神经组织雪旺细胞迁出实验和鉴定：将5～7d SD乳鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精中浸泡5min后，沿大腿后外侧入路，无菌条件下切开皮肤，分离肌肉，暴露并切取双侧坐骨神经，存放在冰板上的培养皿中，解剖显微镜下仔细去除神经外膜，PBS缓冲液反复冲洗3次。用组织剪将其剪碎至约0.5～1mm3大小置于培养皿中，加入适量含10%FBS的DMEM培养基，使培养基刚好浸没组织块，置入含5%CO2的37℃培养箱培养，24h后待组织块基本牢固的贴附在培养皿底部时追加培养基，每日观察。每48h换液一次。待组织块周围细胞长满后，将组织块转移至新的培养皿中继续培养，迁移出的雪旺细胞消化、纯化后行S100染色鉴定。
1.2.4 PLGA神经导管的预处理：动物实验进行的前一天，取真空包装的无菌PLGA神经导管，用含体积分数为10%胎牛血清的培养基预置24h，以增加细胞黏附性，备用。
1.2.5实验分组及神经导管制备：SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只。B，c组填充的自体神经来源于切除的坐骨神经，剪取约1/3神经组织剪成碎屑后疏松充填于神经导管中；将收集的ADSCs配成1×107/ml的细胞悬液，注入充填自体神经组织碎屑的C组PLGA神经导管中。
1.2.6手术方法：将已分组大鼠行3%异戊巴比妥钠（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，无菌条件下于右股后外侧行纵切口，自肌间隙进入，暴露大鼠右侧坐骨神经。自梨状肌下缘切除7mm坐骨神经，两端回缩后造成lOmm神經缺损。A组直接采用PLGA神经导管连接缺损神经，显微镜下将神经的两断端分别套入导管1mm，以10-0显微外科缝线4针固定，分层缝合肌肉和皮肤；B组由内置自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接；C组由内置ADSCs与自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接；D组于坐骨神经中段切取10mm，旋转180°后行端端缝合。术后，将动物置于复苏室中待其苏醒，常规用青霉素抗感染治疗3d，动物房内分笼饲养。
1.3观察指标
1.3.1一般情况：术后观察记录大鼠饮食、精神状态、足部溃疡、肢体活动、自噬现象、伤口有无感染及愈合情况。
1.3.2观察缺损修复部位：术后12周后，按原手术入路暴露。观察神经导管的降解情况，吻合口有无神经瘤形成，再生神经桥接体的形态，与周围组织有无粘连，炎性反应的程度以及腓肠肌的形态大小等。
1.3.3肌电图检测：于暴露部位，采用肌电图仪检测肌肉复合动作电位（CMAPs），以3.5mA、0.05ms、3Hz的电刺激分别于神经吻合口的近端进行刺激，诱发动作电位，并记录动作电位峰值（peak amplitude），肌肉复合动作电位潜伏期（1atency）肌电图检查后，处死大鼠并取材。
取神经桥接体和腓肠肌分别制作冰冻切片和石蜡切片行大体观察、组织化学染色观察及图像分析。
1.3.4再生桥接体的HE、S100、NF和甲苯胺蓝染色：再生的神经桥接体取材后，先置于蔗糖质量体积分数为10%的4%多聚甲醛溶液中固定2h，然后转移至质量体积分数为30%的蔗糖溶液48h，OCT组织包埋剂包埋后制作冰冻切片，切片厚度为8Pm，取桥接体的中段行HE染色、S-100染色、NF染色和甲苯胺蓝染色，显微镜下观察神经组织的再生情况。
1.3.5腓肠肌的HE～Masson染色：将取下的腓肠肌置于4%多聚甲醛液固定24h，酒精梯度脱水，石蜡包埋切片后行HE染色和Masson染色，观察肌纤维的分布和大小，纤维化的程度；测量并计算肌纤维的横截面积和纤维化的比例。
1.4统计学方法：每组数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 ADSCs的形态观察及流式细胞技术鉴定：培养72h后，相差显微镜下观察，细胞已完全贴壁，充分伸展呈梭形，多角形，部分区域形成细胞团簇，周围偶可见少量圆形且发亮的脂滴（图1a、b、c）。经CD29和CD44流式细胞技术鉴定，所获取的细胞为高纯度的ADSCs。
2.2雪旺细胞迁出实验观察及S100鉴定：可见从组织块中迁移出大量的呈梭形，有双极或三极突起，突起细长，中部较亮，折光性强，胞体饱满，胞核明显、呈卵圆形的细胞，符合雪旺细胞的形态特征（图1d、e），且经S100鉴定呈阳性（图1f）。随着时间推移，组织块中迁出的雪旺细胞的数量逐渐增多，组织块的体积逐渐减小。
2.3 PLGA神经导管大体观察及桥接神经缺损观察：神经导管长10mm，内径1.8mm，管壁厚度200μm，为多孔的结构，孔隙大小50～100μm，具有较好的机械强度和韧度（图2a）。神经导管置入后，与神经缺损的两断端接合良好（图2b）。
2.4大体观察：术后大鼠饮食正常，手术伤口均一期愈合，大鼠术侧的肢体活动障碍，足趾出现蜷曲畸形。术后两周各组大鼠患侧出现不同程度的足部肿胀和溃疡，且A组的溃疡程度要比B、C、D组大。C、D组大鼠的足部溃疡在5～6周时基本愈合，B组在6～7周时基本愈合，A组在8～9周时基本愈合，12周时所有大鼠的足部溃疡已全部愈合，大鼠全部存活。12周时按原来的手术入路暴露修复部位，可见神经导管已降解，再生神经桥接体与周围组织无明显粘连，表面可见毛细血管网形成，两端与坐骨神经相连接，吻合口处可见缝线，再生神经中间略细，两端略膨大但未见明显神经瘤形成（图2c）。
2.5神经电生理结果：在设定的刺激参数下，术后12周各组均检测出动作电位。各组动作电位的峰值大小依次为A组B组>c组>D组，且各组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）（图3b）。
2.6神经桥接体的HE、S-100、NF及甲苯胺蓝染色观察：术后12周HE染色可见A组的组织分布较为稀疏、紊乱，而B、C、D组的组织分布较为致密、有序且C、D组相较于B组更为致密、有序，偶可见到少量的炎性细胞浸润（图4 HE）。S-100和NF染色提示C、D组的雪旺细胞的数量和轴突的数量最多，B组的次之，A组的最少（图4 S100、NF）；甲苯胺蓝染色显示D组的有髓神经纤维的数量最多，形态最为规则，C组次之，B组和A组差于C组（图4 TB）。
2.7腓肠肌的HE和Masson染色：术后12周染色可见B、C、D三组的肌纤维致密且粗大，肌细胞形态比较飽满，纤维化程度低，而A组的肌纤维相对稀疏，细胞有所萎缩，可见比较明显的纤维化（图5 HE和Masson）。C组肌纤维平均横截面积稍小于D组（P<0.05），但C、D两组的肌纤维平均横截面积均明显大于A、B两组（P 3讨论
周围神经损伤后，断端远侧段神经纤维的髓鞘及轴突崩解，并被雪旺细胞和巨噬细胞吞噬，发生瓦勒变性（Wallerian degeneration），近侧端也发生类似变化。两端雪旺细胞均分裂增殖形成BUngner带，近端的轴突每天以一定的速度生长，在神经远端趋化因子作用下，在一定距离内再生轴突沿着BUngner带向前延伸并到达神经的远端。数十年来研究者们不断探索应用各种材料的神经导管复合种子细胞修复周围神经缺损。本实验在既往课题组应用PLGA神经导管修复周围神经缺损的研究基础上进行改良，向PLGA导管内充填自体神经组织碎屑和ADSCs来构建细胞神经组织及生物材料形成的人工神经桥接周围神经缺损。
在体外神经组织雪旺细胞迁出实验中发现，将离体的神经组织剪成约0.5～1mm3大小的碎屑，雪旺细胞可以逐渐从组织块中迁移出，且随着时间的变化，从组织块中迁出的雪旺细胞逐渐增多，在其他学者的研究中也有类似发现。雪旺细胞作为周围神经再生最重要的种子细胞，不仅参与吞噬变性的轴突和髓鞘的形成，还分泌多种细胞外基质（ECM）成分和神经营养因子，包括NGF，BDNF，GDNF等，可以引导轴突的定向生长，在轴突再生后包绕神经轴突，促进再生神经的成熟，调节神经肌肉突触活动。以往研究多采用异体雪旺细胞在体外培养扩增后加入神经导管内，由于雪旺细胞培养增殖要求较高，涉及酶消化，纯化，鉴定及扩增，接种后存在一定的排异反应，存活的细胞数量和功能都较低。本实验设计直接将自体神经组织碎屑剪碎后充填于神经导管中，在通透性良好的PLGA导管内，神经组织碎屑很容易固定在导管内壁，类似体外培养皿内神经组织碎屑培养环境，因此推测在大鼠体内不仅产生的雪旺细胞数量有保障，且无异体雪旺细胞可能出现的排斥反应和功能降低。本实验还充分利用自体神经碎屑的基质成份作为内部支架结构，为细胞的粘附和轴突的生长提供支持和引导。体外实验发现神经组织块在培养过程中随着雪旺细胞的迁移体积逐渐变小，表明其可在神经再生过程早期于神经导管内部作为支架材料，防止导管塌陷，后期随着体积逐渐缩小亦有利于再生神经轴突通过。在临床工作中若切取少量神经断端组织、较不重要区域的神经组织、抑或是切除下的痛性神经瘤组织，充分剪碎后将其充填于神经导管中，一方面可作为种子细胞的来源，另一方面作为内部支架材料也是可行的。
周围神经损伤后再生过程中，雪旺细胞合成分泌多种神经营养因子及其他细胞粘附分子，并与相邻轴突形成缝隙连接或紧密连接，是许多小分子物质和信息传递的直接通道，其数量和功能是相当重要的，但在损伤早期很难达到所需浓度。然而有研究者将ADSCs移植到周围神经损伤处，发现其可促进周围神经的再生。ADSCs具有多向分化潜能特性，ADSCs多次传代后，仍具有正常的2倍体核型，且不随传代次数增加而发生明显改变。此外，ADSCs来源广泛、分离培养方法简单、扩增能力强、低水平衰老、低免疫性等特点，使其成为促进神经再生的重要细胞来源。Tomita等将人的ADSCs体外诱导形成雪旺细胞样细胞，证实诱导分化的细胞可以像人类雪旺细胞一样分泌BDNF、NGF，甚至分泌的GDNF比雪旺细胞还要多，将诱导分化的带有GFP标记的ADSCs注射到胫神经嵌压伤的大鼠体内，8周后可看到1/3的细胞存在于周围轴突中，产生髓鞘蛋白，并促进髓鞘的生成，证明了ADSCs经诱导形成的雪旺细胞样细胞可促进周围神经再生。Kingham等将诱导分化的ADSCs移植到大鼠坐骨神经横断损伤处，2周后发现移植组大鼠的坐骨神经再生的轴突长度较对照组长。此外，雪旺细胞和ADSCs在神经修复的过程中可能存在协同作用。Sowa等证实含有ADSCs分泌的细胞因子的培养基能够支持雪旺细胞的存活和增殖。Dai等发现雪旺细胞联合ADSCs修复周围神经缺损的效果要优于单纯应用雪旺细胞的修复效果。而对于在神经损伤处移植ADSCs的浓度及其分化程度研究者还存在一定的争论。
本实验先将自体神经碎屑充填于PLGA神经导管内，然后再将体外环境下分离和培养的ADSCs植入导管内，细胞浓度为1×107/ml，来修复大鼠坐骨神经缺损，于12周取材后发现，神经导管联合ADSCs和自体神经组织碎屑组C组的神经再生与A、B组比较，C组的复合肌肉动作电位的峰值高，潜伏期短，再生神经的轴突直径及髓鞘厚度均有优势。C组大鼠腓肠肌的HE和Masson染色结果也证实大鼠再生神经的质量优于A、B组。本实验研究结果与Gu等将ADSCs注射移植到硅胶管中修复大鼠坐骨神经缺损实验结果相似，表明联合ADSCs和神经组织碎屑的神经导管能促进周围神经再生。
本实验中所用的PLGA神经导管具有良好的生物相容性和可降解性，且为多孔的结构，不仅可以将导管内部的结构和神经断端与周围组织分隔，减少炎性组织的浸润和减轻周围组织的压迫，还可以实现导管内的组织与周围的环境进行物质交换和信息交流。
总之，PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑可以有效地修复大鼠坐骨神缺损，修复效果总体上虽稍差于自体神经移植，但我们相信随着研究的深入，修复效果会得到更大程度的改善，甚至达到与自体神经移植修复相媲美的效果。
[关键词]周围神经缺损；神经组织碎屑；脂肪干细胞；聚乳酸羟基乙酸；神经导管
[中图分类号]R745 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0060-06
周围神经缺损是临床上常见的疾病，外伤、手术操作、肿瘤切除等均会导致周围神经缺损的发生，对于普通的神经离断损伤可以在无张力的条件下用端端吻合的方法修复。而对于较长节段神经缺损的修复，目前的金标准是自体神经移植，但是自体神经移植具有供区来源有限、二次损伤、供区的感觉功能障碍、供区和受区神经结构和粗细不匹配等缺点。鉴于自体神经移植的诸多限制，组织工程神经导管应运而生，人们早期曾使用空腔静脉导管修复周围神经缺损，后来有学者采用在静脉内填充神经碎屑来修复周围神经缺损，均取得了比较好的修复效果。近年来聚乳酸羟基乙酸（poly-lactic-co-glycolic-acid，PLGA）神经导管以其优越的性能受到学者们的重视且已被广泛应用于各研究中，其性能也得到进一步完善，如对导管进行甲壳素涂层来改善导管的生物学性能；在导管内置入纤维丝改善神经导管的内部空间结构等。有研究发现PLGA材料复合雪旺细胞、细胞生长因子、间充质干细胞或脂肪干细胞（adipose derived stem ceils，ADSCs）后能促进轴突的再生和髓鞘的形成以及神经功能的恢复。本实验设计以PLGA神经导管为支架材料，将自体来源的神经碎屑，复合ADSCs填充到神经导管中，探讨此种联合自体神经组织和ADSCs的具有内部空间结构的神经导管修复周围神经缺损的效果。
1材料和方法
1.1材料与设备：健康成年SD大鼠32只，雌性，体重200～250g（上海斯莱克动物实验有限公司）；5～7d SD乳鼠若干只，体重（16.0±2.1）g（上海斯莱克动物实验有限公司）。
DMEM培养基（Hyclone）、复合胶原酶NB4（Serva，Germany）、胎牛血清（Hyclone，Australia）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.2 5%trypsin-EDTA（Gibco，Canada）、兔抗单克隆neurofilament-H（Millipore，USA）、兔抗S100单克隆抗体（Dako，Denmark）、驴抗兔IgG抗体（Invitrogen，USA）、Masson染色试剂盒（Leagene）、Calcein-AM（上海麦约尔生物技术有限公司）、甲苯胺蓝。PLGA导管材料由东华大学提供。
倒置相差显微镜（Olympus，Japan）、恒温CO2培养箱（Forma Scientific，USA）离心机（Thermo，USA）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）、正置显微镜（Nikon 90i，Japan）、Evos显微镜（Life，USA）、荧光显微镜（Nikon，Japan）、冰冻切片机（Shandon Cryotome FSE，Thermo scientific，British）、Key point多道肌电图仪（Dantec，丹麦）、石蜡切片机（Shandon Finesse 325，Thermo Shandon Ltd.，British）、解剖显微镜（Motic，USA）、显微外科手术器械（上海手术器械厂，中国）。
1.2实验方法
1.2.1 PLGA神经导管的准备：取PLGA神经导管，环氧乙烷消毒，真空包装备用。
1.2.2 ADSCs的取材、培养、观察和鉴定：将5～7d SD乳鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精中浸泡5min后，无菌条件下取其腹股沟皮下脂肪组织，置入培养皿中，向皿中加入含2%FBS的冷PBS洗去血液。将脂肪块剪碎至约1mm3大小，向培养皿中加入0.2%复合胶原酶NB4（用DMEM培养基配制），转移至一次性离心管中，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。每隔5min振荡1次，消化约1.5h，反复吹打约5min，使组织充分分散。以1500rpm、37℃、离心5min，弃去上清，加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，按大约1×103/cm2密度将细胞接种到培养皿中，置于37℃、5%COz培养箱培养。待原代细胞长满至培养皿的80%左右，吸去上清液，PBS漂洗后，加37℃、0.25%trypsin-EDTA消化約1min，轻轻拍打培养皿使细胞从皿底脱离，加入含血清的DMEM培养基终止消化，收集所得细胞，以1500rpm、37℃、离心5min，培养液重悬，按1：2的比例传代接种，置于37℃、5%CO2培养箱继续培养，每48h换液一次，待细胞增殖至覆盖皿底80%时，用同样方法传代，传至第三代，行Calcein-AM荧光染色后镜下进行细胞形态学观察，参照张怡等的实验方法对脂肪干细胞行CD29和CD44细胞流式技术鉴定，并对脂肪干细胞培养备用。 1.2.3神经组织雪旺细胞迁出实验和鉴定：将5～7d SD乳鼠颈椎脱臼处死，置于75%酒精中浸泡5min后，沿大腿后外侧入路，无菌条件下切开皮肤，分离肌肉，暴露并切取双侧坐骨神经，存放在冰板上的培养皿中，解剖显微镜下仔细去除神经外膜，PBS缓冲液反复冲洗3次。用组织剪将其剪碎至约0.5～1mm3大小置于培养皿中，加入适量含10%FBS的DMEM培养基，使培养基刚好浸没组织块，置入含5%CO2的37℃培养箱培养，24h后待组织块基本牢固的贴附在培养皿底部时追加培养基，每日观察。每48h换液一次。待组织块周围细胞长满后，将组织块转移至新的培养皿中继续培养，迁移出的雪旺细胞消化、纯化后行S100染色鉴定。
1.2.4 PLGA神经导管的预处理：动物实验进行的前一天，取真空包装的无菌PLGA神经导管，用含体积分数为10%胎牛血清的培养基预置24h，以增加细胞黏附性，备用。
1.2.5实验分组及神经导管制备：SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只。B，c组填充的自体神经来源于切除的坐骨神经，剪取约1/3神经组织剪成碎屑后疏松充填于神经导管中；将收集的ADSCs配成1×107/ml的细胞悬液，注入充填自体神经组织碎屑的C组PLGA神经导管中。
1.2.6手术方法：将已分组大鼠行3%异戊巴比妥钠（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，无菌条件下于右股后外侧行纵切口，自肌间隙进入，暴露大鼠右侧坐骨神经。自梨状肌下缘切除7mm坐骨神经，两端回缩后造成lOmm神經缺损。A组直接采用PLGA神经导管连接缺损神经，显微镜下将神经的两断端分别套入导管1mm，以10-0显微外科缝线4针固定，分层缝合肌肉和皮肤；B组由内置自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接；C组由内置ADSCs与自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接；D组于坐骨神经中段切取10mm，旋转180°后行端端缝合。术后，将动物置于复苏室中待其苏醒，常规用青霉素抗感染治疗3d，动物房内分笼饲养。
1.3观察指标
1.3.1一般情况：术后观察记录大鼠饮食、精神状态、足部溃疡、肢体活动、自噬现象、伤口有无感染及愈合情况。
1.3.2观察缺损修复部位：术后12周后，按原手术入路暴露。观察神经导管的降解情况，吻合口有无神经瘤形成，再生神经桥接体的形态，与周围组织有无粘连，炎性反应的程度以及腓肠肌的形态大小等。
1.3.3肌电图检测：于暴露部位，采用肌电图仪检测肌肉复合动作电位（CMAPs），以3.5mA、0.05ms、3Hz的电刺激分别于神经吻合口的近端进行刺激，诱发动作电位，并记录动作电位峰值（peak amplitude），肌肉复合动作电位潜伏期（1atency）肌电图检查后，处死大鼠并取材。
取神经桥接体和腓肠肌分别制作冰冻切片和石蜡切片行大体观察、组织化学染色观察及图像分析。
1.3.4再生桥接体的HE、S100、NF和甲苯胺蓝染色：再生的神经桥接体取材后，先置于蔗糖质量体积分数为10%的4%多聚甲醛溶液中固定2h，然后转移至质量体积分数为30%的蔗糖溶液48h，OCT组织包埋剂包埋后制作冰冻切片，切片厚度为8Pm，取桥接体的中段行HE染色、S-100染色、NF染色和甲苯胺蓝染色，显微镜下观察神经组织的再生情况。
1.3.5腓肠肌的HE～Masson染色：将取下的腓肠肌置于4%多聚甲醛液固定24h，酒精梯度脱水，石蜡包埋切片后行HE染色和Masson染色，观察肌纤维的分布和大小，纤维化的程度；测量并计算肌纤维的横截面积和纤维化的比例。
1.4统计学方法：每组数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 ADSCs的形态观察及流式细胞技术鉴定：培养72h后，相差显微镜下观察，细胞已完全贴壁，充分伸展呈梭形，多角形，部分区域形成细胞团簇，周围偶可见少量圆形且发亮的脂滴（图1a、b、c）。经CD29和CD44流式细胞技术鉴定，所获取的细胞为高纯度的ADSCs。
2.2雪旺细胞迁出实验观察及S100鉴定：可见从组织块中迁移出大量的呈梭形，有双极或三极突起，突起细长，中部较亮，折光性强，胞体饱满，胞核明显、呈卵圆形的细胞，符合雪旺细胞的形态特征（图1d、e），且经S100鉴定呈阳性（图1f）。随着时间推移，组织块中迁出的雪旺细胞的数量逐渐增多，组织块的体积逐渐减小。
2.3 PLGA神经导管大体观察及桥接神经缺损观察：神经导管长10mm，内径1.8mm，管壁厚度200μm，为多孔的结构，孔隙大小50～100μm，具有较好的机械强度和韧度（图2a）。神经导管置入后，与神经缺损的两断端接合良好（图2b）。
2.4大体观察：术后大鼠饮食正常，手术伤口均一期愈合，大鼠术侧的肢体活动障碍，足趾出现蜷曲畸形。术后两周各组大鼠患侧出现不同程度的足部肿胀和溃疡，且A组的溃疡程度要比B、C、D组大。C、D组大鼠的足部溃疡在5～6周时基本愈合，B组在6～7周时基本愈合，A组在8～9周时基本愈合，12周时所有大鼠的足部溃疡已全部愈合，大鼠全部存活。12周时按原来的手术入路暴露修复部位，可见神经导管已降解，再生神经桥接体与周围组织无明显粘连，表面可见毛细血管网形成，两端与坐骨神经相连接，吻合口处可见缝线，再生神经中间略细，两端略膨大但未见明显神经瘤形成（图2c）。
2.5神经电生理结果：在设定的刺激参数下，术后12周各组均检测出动作电位。各组动作电位的峰值大小依次为A组
2.7腓肠肌的HE和Masson染色：术后12周染色可见B、C、D三组的肌纤维致密且粗大，肌细胞形态比较飽满，纤维化程度低，而A组的肌纤维相对稀疏，细胞有所萎缩，可见比较明显的纤维化（图5 HE和Masson）。C组肌纤维平均横截面积稍小于D组（P<0.05），但C、D两组的肌纤维平均横截面积均明显大于A、B两组（P
周围神经损伤后，断端远侧段神经纤维的髓鞘及轴突崩解，并被雪旺细胞和巨噬细胞吞噬，发生瓦勒变性（Wallerian degeneration），近侧端也发生类似变化。两端雪旺细胞均分裂增殖形成BUngner带，近端的轴突每天以一定的速度生长，在神经远端趋化因子作用下，在一定距离内再生轴突沿着BUngner带向前延伸并到达神经的远端。数十年来研究者们不断探索应用各种材料的神经导管复合种子细胞修复周围神经缺损。本实验在既往课题组应用PLGA神经导管修复周围神经缺损的研究基础上进行改良，向PLGA导管内充填自体神经组织碎屑和ADSCs来构建细胞神经组织及生物材料形成的人工神经桥接周围神经缺损。
在体外神经组织雪旺细胞迁出实验中发现，将离体的神经组织剪成约0.5～1mm3大小的碎屑，雪旺细胞可以逐渐从组织块中迁移出，且随着时间的变化，从组织块中迁出的雪旺细胞逐渐增多，在其他学者的研究中也有类似发现。雪旺细胞作为周围神经再生最重要的种子细胞，不仅参与吞噬变性的轴突和髓鞘的形成，还分泌多种细胞外基质（ECM）成分和神经营养因子，包括NGF，BDNF，GDNF等，可以引导轴突的定向生长，在轴突再生后包绕神经轴突，促进再生神经的成熟，调节神经肌肉突触活动。以往研究多采用异体雪旺细胞在体外培养扩增后加入神经导管内，由于雪旺细胞培养增殖要求较高，涉及酶消化，纯化，鉴定及扩增，接种后存在一定的排异反应，存活的细胞数量和功能都较低。本实验设计直接将自体神经组织碎屑剪碎后充填于神经导管中，在通透性良好的PLGA导管内，神经组织碎屑很容易固定在导管内壁，类似体外培养皿内神经组织碎屑培养环境，因此推测在大鼠体内不仅产生的雪旺细胞数量有保障，且无异体雪旺细胞可能出现的排斥反应和功能降低。本实验还充分利用自体神经碎屑的基质成份作为内部支架结构，为细胞的粘附和轴突的生长提供支持和引导。体外实验发现神经组织块在培养过程中随着雪旺细胞的迁移体积逐渐变小，表明其可在神经再生过程早期于神经导管内部作为支架材料，防止导管塌陷，后期随着体积逐渐缩小亦有利于再生神经轴突通过。在临床工作中若切取少量神经断端组织、较不重要区域的神经组织、抑或是切除下的痛性神经瘤组织，充分剪碎后将其充填于神经导管中，一方面可作为种子细胞的来源，另一方面作为内部支架材料也是可行的。
周围神经损伤后再生过程中，雪旺细胞合成分泌多种神经营养因子及其他细胞粘附分子，并与相邻轴突形成缝隙连接或紧密连接，是许多小分子物质和信息传递的直接通道，其数量和功能是相当重要的，但在损伤早期很难达到所需浓度。然而有研究者将ADSCs移植到周围神经损伤处，发现其可促进周围神经的再生。ADSCs具有多向分化潜能特性，ADSCs多次传代后，仍具有正常的2倍体核型，且不随传代次数增加而发生明显改变。此外，ADSCs来源广泛、分离培养方法简单、扩增能力强、低水平衰老、低免疫性等特点，使其成为促进神经再生的重要细胞来源。Tomita等将人的ADSCs体外诱导形成雪旺细胞样细胞，证实诱导分化的细胞可以像人类雪旺细胞一样分泌BDNF、NGF，甚至分泌的GDNF比雪旺细胞还要多，将诱导分化的带有GFP标记的ADSCs注射到胫神经嵌压伤的大鼠体内，8周后可看到1/3的细胞存在于周围轴突中，产生髓鞘蛋白，并促进髓鞘的生成，证明了ADSCs经诱导形成的雪旺细胞样细胞可促进周围神经再生。Kingham等将诱导分化的ADSCs移植到大鼠坐骨神经横断损伤处，2周后发现移植组大鼠的坐骨神经再生的轴突长度较对照组长。此外，雪旺细胞和ADSCs在神经修复的过程中可能存在协同作用。Sowa等证实含有ADSCs分泌的细胞因子的培养基能够支持雪旺细胞的存活和增殖。Dai等发现雪旺细胞联合ADSCs修复周围神经缺损的效果要优于单纯应用雪旺细胞的修复效果。而对于在神经损伤处移植ADSCs的浓度及其分化程度研究者还存在一定的争论。
本实验先将自体神经碎屑充填于PLGA神经导管内，然后再将体外环境下分离和培养的ADSCs植入导管内，细胞浓度为1×107/ml，来修复大鼠坐骨神经缺损，于12周取材后发现，神经导管联合ADSCs和自体神经组织碎屑组C组的神经再生与A、B组比较，C组的复合肌肉动作电位的峰值高，潜伏期短，再生神经的轴突直径及髓鞘厚度均有优势。C组大鼠腓肠肌的HE和Masson染色结果也证实大鼠再生神经的质量优于A、B组。本实验研究结果与Gu等将ADSCs注射移植到硅胶管中修复大鼠坐骨神经缺损实验结果相似，表明联合ADSCs和神经组织碎屑的神经导管能促进周围神经再生。
本实验中所用的PLGA神经导管具有良好的生物相容性和可降解性，且为多孔的结构，不仅可以将导管内部的结构和神经断端与周围组织分隔，减少炎性组织的浸润和减轻周围组织的压迫，还可以实现导管内的组织与周围的环境进行物质交换和信息交流。
总之，PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑可以有效地修复大鼠坐骨神缺损，修复效果总体上虽稍差于自体神经移植，但我们相信随着研究的深入，修复效果会得到更大程度的改善，甚至达到与自体神经移植修复相媲美的效果。