为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒（CDV）野毒株与疫苗株的方法，试验根据GenBank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物，建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性；利用建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法对2017—2020年采集于江苏省11个不同地市的505份发病犬喉拭子样品和病料样品进行检测，确定CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR的临床适用性。结果表明：该方法对CDV野毒株、CDV疫苗株、CDV野毒株/疫苗株可分别扩增出477 bp、677 bp、477 bp/677 bp的特异性条带，而检测犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬冠状病毒（CCV）均为阴性；该方法的检测灵敏度为23.1 pg RNA;与RFLP方法的符合率为100%;批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致；利用该方法检测505份临床样品，CDV野毒株和疫苗株的阳性率分别为8.91%和72.48%。说明建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性。