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[摘要] 目的 探讨采用PCR和细胞培养方法比较流感样病例不同标本的流感病毒检出情况。方法 分析我中心2013年12月～2014年3月收集的流感指征患者193例作为研究对象，分别采集鼻拭子和咽拭子各1份，分别通过荧光PCR、细胞培养对流感病毒进行检测。 结果 鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过PCR和MDCK细胞接种中阳性率高于咽拭子（P<0.05），另外A （H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，差异有统计学意义（P<0.05）。而在H3N2亚型检出率中二者无明显差异（P>0.05）。 结论 流感病毒监测过程中，根据当地流行主要流感病毒亚型来选择鼻拭子和咽拭子，对于提高流感病毒检出率具有很重要的意义。
[关键词] 荧光PCR；细胞培养；流感病毒；检出
[中图分类号] R511.7 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）15-147-03
[Abstract] Objective To explore influenza virus detection of different specimen for influenza-like cases by polymerase chain reaction （PCR） and cell culture. Methods 193 patients with influenza indications who were admitted to our center from December 2013 to March 2014 were selected as research objects. One nose swab and one throat swab were respectively collected and influenza virus was respectively detected by fluorescent PCR and cell culture. Results Nose swab was more sensitive to B subtype influenza virus and positive rate of nose swab by PCR and Madin Darby canine kidney （MDCK） cell culture was higher than that of the throat swab（P<0.05）. In addition， detection rate of A （H1N1） pdm09 subtype of throat swab were higher than that of the nose swab （P<0.05）. The difference was statistical significant. But the detection rate of H3N2 of nose swab and throat swab had no significant difference（P>0.05）. Conclusion In influenza virus detection process， choosing nose swab or throat swab according to local prevalent influenza virus subtype has important significance in improving detection rate of influenza virus.
[Key words] Fluorescent PCR； Cell culture； Influenza virus； Detection
流感是目前常见的传染性疾病，每年在全世界范围内有大量的流行性感冒发生，其也会造成一定数量的死亡[1-2]。随着我国流感监测网络的逐步完善，对于流感样标本的采集数量和种类也明显增多[3-4]。本研究通过对我中心收集的193例流感病例情况进行分析，拟探讨采用PCR和细胞培养方法比较流感样病例不同标本的流感病毒检出情况，现将结果汇报如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我中心2013年12月～2014年3月收集的流感指征患者193例作为研究对象，患者发热≥38℃，伴有不同程度的咳嗽或者咽喉痛等急性呼吸道感染症状。采用Copan公司生产的绒毛拭子对患者标本进行采集。
1.2 方法
采用绒毛拭子分别采集鼻拭子和咽拭子各1份，按照《全国流感监测技术指南》中的操作步骤进行，拭子采集完毕后放入15mL螺口管内，其中装有Eagels采样液，4℃保存，48h内进行检测。标本到达实验室进行登记，保证标本各项记录资料完整，对标本振荡15s，促使绒毛拭子在管壁内进行反复性的挤压，然后从中取出，分为3份。一份采用荧光PCR检测，一份采用MDCK细胞接种，第三份保存进行复核。
荧光PCR：通过梅里埃自动核酸抽取仪进行核酸抽提，采用200μL样品抽提从而获得60μL核酸，通过甲乙型流感病毒RNA检测试剂盒进行检测，甲型流感病毒标本继续采用季节性H1亚型流感病毒RNA、季节性H3亚型流感病毒RNA和甲型H1N1流感病毒RNA进行亚型检测。操作步骤严格按照试剂盒操作规程进行。Ct值≤35为阳性判定标准，如果阴阳性对照有偏差，进行重复检测。
MDCK细胞接种按照《全国流感检测技术指南》标准进行[5-6]。
1.3 统计学分析
采用统计学软件SPSS 19.0建立数据库，通过x2检验进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR阳性标本中鼻拭子和咽拭子检测阳性例数和阳性率分布情况 所有研究对象均做鼻拭子和咽拭子检测，鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过PCR检测阳性率高于咽拭子，x2=3.68，P=0.032，另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，x2=4.16，P=0.023，差异有统计学意义。而在H3N2亚型中二者无明显差异，x2=0.69，P=0.158。见表1。
2.2 MDCK标本中鼻拭子和咽拭子检测阳性例数和阳性率分布情况
鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过MDCK细胞接种阳性率高于咽拭子，x2=4.29，P=0.021，另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，x2=5.10，P=0.018，差异有统计学意义。而在H3N2亚型中二者无明显差异，x2=0.78，P=0.149。见表2。
3 讨论
流感采集标本种类繁多，主要包括鼻拭子、咽拭子、下呼吸道吸取物、盥洗液、痰液及唾液等，其中拭子采集方法简便易行，患者的接受程度较好，在临床较为常用[7-8]。同时采集单份的鼻拭子或者咽拭子难度较小，明显低于鼻咽双份拭子，同时单独采集某种拭子所需要的成本和时间均较低，从而提高了流感肌层监测哨点医院的工作效率。以往的研究表明[9-10]，鼻拭子流感病毒的检测率高于咽拭子，但是对于较高的致病性禽流感H5N1在咽拭子检出率较高，因而说明不同的流感病毒类别在鼻咽拭子中的检出率有一定的差异性。研究表明[11-12]，流感样本采集部位和采集后获取的呼吸道上皮细胞含量决定着采样质量。目前我中心采用植绒拭子，其检出率是普通人造纤维拭子的4～5倍。鼻拭子和咽拭子混合之后对于呼吸道流感病毒的检出率较高，但是对于基层的流感监测网络，植绒拭子成本较高，很难对哨点医院均采取双份拭子标本的采集，往往只是采集单份样本。鼻拭子被认为其呼吸道上皮细胞流感病毒低于咽拭子，因而提示可能不同类型流感病毒对于定居部位有其特异性，采集拭子时，最好根据目前流行流感病毒类型，选择相对来说检出率较高部位进行标本的采集，从而提高流感病毒的检出率[13-14]。本研究分析我中心2013年12月～2014年3月收集的流感指征患者193例作为研究对象，分别采集鼻拭子和咽拭子各1份，分别通过荧光PCR、细胞培养对流感病毒进行检测，结果表明，鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过PCR和MDCK细胞接种中阳性率高于咽拭子，提示鼻拭子中检测B亚型流感病毒检出率较高，而咽拭子中PCR和MDCK细胞接种的阳性率相对较低。而在H3N2亚型中二者无明显差异。另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，和以往研究基本一致[15]。上述研究结果表明，咽拭子采集部位较低，接近于下呼吸道，对于一些诱发下呼吸道感染的肺部炎症和肺泡损伤的流感亚型，检出率较高。上述研究结果提示，A（H1N1）pdm09多定居在咽部，而B型流感病毒往往多定居在鼻腔底部。不同采集部位对于不同型别的流感病毒敏感性也有所不同，也就是说在日常流感监测过程中，尤其是流感局部爆发过程中，我们需要同时采集鼻拭子和咽拭子进行阳性筛查，从而提高流感病毒的检出率。
综上所述，流感病毒监测过程中，根据当地流行主要流感病毒亚型来选择鼻拭子和咽拭子，对于提高流感病毒检出率具有很重要的意义。
[参考文献]
[1] 曾祥洁，潘家兴，李臻，等. 荧光定量 PCR法快速检测海南省流感样病例样本的结果与分析[J].现代预防医学，2008，35（17）：3375-3377.
[2] Bardiya N，Bae JH.Influenza vaccines：Recent advances in production technologies[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2005，67（3）：299-305.
[3] 葛琴娟，杨静，孙晋飞，等.实时荧光定量 PCR法检测镇江市流感样病例样本的结果与分析[J].实用预防医学，2010，17（4）：755-757.
[4] Girard MP，Cherian T，Pervikov Y，et a1.A review of vaccine research and development：Human acute respiratory infections[J].Vaccine，2005，23（50）：5708-5724.
[5] 王志强，刘晓华，张红，狗肾传代细胞培养分离技术分离流感病毒的初步应用[J].疾病预防控制通报，2012，27（6）：56-57.
[6] 张萍，韩文清，宫连凤，等，实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用[J].中国病原生物学杂志，2011，6（1）：45-46.
[7] 耿兴良，戴宗祥，段盼盼，等.Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选[J].中国生物制品学杂志，2014，27（5）：687-690.
[8] 吴俊东，朱凤才.流感疫苗研究的进展[J].江苏预防医学，2008，19（2）：83-85.
[9] 宋黎黎，赵百慧，褚维，等.采用PCR和细胞培养方法比较流感样病例不同标本的流感病毒检出情况[J].中国卫生检验杂志，2013，23（4）：892-895.
[10] Tabla VO，Masiá M，Antequera P，et al.Comparison of combined nose-throat swabs with nasopharyngeal aspirates for detection of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus by real-time reverse transcriptase PCR[J].J Clin Microbiol，2010，48（10）：3492-3495.
[11] 张欣，闫惠平，马胤雪，等.不同方法检测流行性感冒样病例鼻咽和口咽拭子标本诊断甲型流行性感冒的评价[J].中华传染病杂志，2011，29（3）：154-157.
[12] 刘铮，孙明波，高菁霞，等. 低血清培养 Vero 细胞和流感病毒条件的优化[J].中国生物制品学杂志，2009，22（6）：593-595.
[13] Job ER，Bottazzi B，Gilbertson B，et al. Serum amyloid P is a sialylated glycoprotein inhibitor of influenza A viruses[J].PLoS One，2013，8（3）：e59623.
[14] 罗振武，邱丰，魏晓露，等. 流感病毒在 Vero 细胞上的适应性[J].中国生物制品学杂志，2008，21（4）：304-307.
[15] 卢勇，宋绍辉，蔡玮，等. ELISA 法检测 H3N2 亚型流感病毒 Vero 细胞适应株[J].现代生物医学进展，2013，13（10）：1811-1815.
（收稿日期：2015-04-29）
[关键词] 荧光PCR；细胞培养；流感病毒；检出
[中图分类号] R511.7 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）15-147-03
[Abstract] Objective To explore influenza virus detection of different specimen for influenza-like cases by polymerase chain reaction （PCR） and cell culture. Methods 193 patients with influenza indications who were admitted to our center from December 2013 to March 2014 were selected as research objects. One nose swab and one throat swab were respectively collected and influenza virus was respectively detected by fluorescent PCR and cell culture. Results Nose swab was more sensitive to B subtype influenza virus and positive rate of nose swab by PCR and Madin Darby canine kidney （MDCK） cell culture was higher than that of the throat swab（P<0.05）. In addition， detection rate of A （H1N1） pdm09 subtype of throat swab were higher than that of the nose swab （P<0.05）. The difference was statistical significant. But the detection rate of H3N2 of nose swab and throat swab had no significant difference（P>0.05）. Conclusion In influenza virus detection process， choosing nose swab or throat swab according to local prevalent influenza virus subtype has important significance in improving detection rate of influenza virus.
[Key words] Fluorescent PCR； Cell culture； Influenza virus； Detection
流感是目前常见的传染性疾病，每年在全世界范围内有大量的流行性感冒发生，其也会造成一定数量的死亡[1-2]。随着我国流感监测网络的逐步完善，对于流感样标本的采集数量和种类也明显增多[3-4]。本研究通过对我中心收集的193例流感病例情况进行分析，拟探讨采用PCR和细胞培养方法比较流感样病例不同标本的流感病毒检出情况，现将结果汇报如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我中心2013年12月～2014年3月收集的流感指征患者193例作为研究对象，患者发热≥38℃，伴有不同程度的咳嗽或者咽喉痛等急性呼吸道感染症状。采用Copan公司生产的绒毛拭子对患者标本进行采集。
1.2 方法
采用绒毛拭子分别采集鼻拭子和咽拭子各1份，按照《全国流感监测技术指南》中的操作步骤进行，拭子采集完毕后放入15mL螺口管内，其中装有Eagels采样液，4℃保存，48h内进行检测。标本到达实验室进行登记，保证标本各项记录资料完整，对标本振荡15s，促使绒毛拭子在管壁内进行反复性的挤压，然后从中取出，分为3份。一份采用荧光PCR检测，一份采用MDCK细胞接种，第三份保存进行复核。
荧光PCR：通过梅里埃自动核酸抽取仪进行核酸抽提，采用200μL样品抽提从而获得60μL核酸，通过甲乙型流感病毒RNA检测试剂盒进行检测，甲型流感病毒标本继续采用季节性H1亚型流感病毒RNA、季节性H3亚型流感病毒RNA和甲型H1N1流感病毒RNA进行亚型检测。操作步骤严格按照试剂盒操作规程进行。Ct值≤35为阳性判定标准，如果阴阳性对照有偏差，进行重复检测。
MDCK细胞接种按照《全国流感检测技术指南》标准进行[5-6]。
1.3 统计学分析
采用统计学软件SPSS 19.0建立数据库，通过x2检验进行分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR阳性标本中鼻拭子和咽拭子检测阳性例数和阳性率分布情况 所有研究对象均做鼻拭子和咽拭子检测，鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过PCR检测阳性率高于咽拭子，x2=3.68，P=0.032，另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，x2=4.16，P=0.023，差异有统计学意义。而在H3N2亚型中二者无明显差异，x2=0.69，P=0.158。见表1。
2.2 MDCK标本中鼻拭子和咽拭子检测阳性例数和阳性率分布情况
鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过MDCK细胞接种阳性率高于咽拭子，x2=4.29，P=0.021，另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，x2=5.10，P=0.018，差异有统计学意义。而在H3N2亚型中二者无明显差异，x2=0.78，P=0.149。见表2。
3 讨论
流感采集标本种类繁多，主要包括鼻拭子、咽拭子、下呼吸道吸取物、盥洗液、痰液及唾液等，其中拭子采集方法简便易行，患者的接受程度较好，在临床较为常用[7-8]。同时采集单份的鼻拭子或者咽拭子难度较小，明显低于鼻咽双份拭子，同时单独采集某种拭子所需要的成本和时间均较低，从而提高了流感肌层监测哨点医院的工作效率。以往的研究表明[9-10]，鼻拭子流感病毒的检测率高于咽拭子，但是对于较高的致病性禽流感H5N1在咽拭子检出率较高，因而说明不同的流感病毒类别在鼻咽拭子中的检出率有一定的差异性。研究表明[11-12]，流感样本采集部位和采集后获取的呼吸道上皮细胞含量决定着采样质量。目前我中心采用植绒拭子，其检出率是普通人造纤维拭子的4～5倍。鼻拭子和咽拭子混合之后对于呼吸道流感病毒的检出率较高，但是对于基层的流感监测网络，植绒拭子成本较高，很难对哨点医院均采取双份拭子标本的采集，往往只是采集单份样本。鼻拭子被认为其呼吸道上皮细胞流感病毒低于咽拭子，因而提示可能不同类型流感病毒对于定居部位有其特异性，采集拭子时，最好根据目前流行流感病毒类型，选择相对来说检出率较高部位进行标本的采集，从而提高流感病毒的检出率[13-14]。本研究分析我中心2013年12月～2014年3月收集的流感指征患者193例作为研究对象，分别采集鼻拭子和咽拭子各1份，分别通过荧光PCR、细胞培养对流感病毒进行检测，结果表明，鼻拭子对B亚型流感病毒敏感性较高，通过PCR和MDCK细胞接种中阳性率高于咽拭子，提示鼻拭子中检测B亚型流感病毒检出率较高，而咽拭子中PCR和MDCK细胞接种的阳性率相对较低。而在H3N2亚型中二者无明显差异。另外A（H1N1）pdm09亚型在咽拭子中检出率较高，和以往研究基本一致[15]。上述研究结果表明，咽拭子采集部位较低，接近于下呼吸道，对于一些诱发下呼吸道感染的肺部炎症和肺泡损伤的流感亚型，检出率较高。上述研究结果提示，A（H1N1）pdm09多定居在咽部，而B型流感病毒往往多定居在鼻腔底部。不同采集部位对于不同型别的流感病毒敏感性也有所不同，也就是说在日常流感监测过程中，尤其是流感局部爆发过程中，我们需要同时采集鼻拭子和咽拭子进行阳性筛查，从而提高流感病毒的检出率。
综上所述，流感病毒监测过程中，根据当地流行主要流感病毒亚型来选择鼻拭子和咽拭子，对于提高流感病毒检出率具有很重要的意义。
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[1] 曾祥洁，潘家兴，李臻，等. 荧光定量 PCR法快速检测海南省流感样病例样本的结果与分析[J].现代预防医学，2008，35（17）：3375-3377.
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[10] Tabla VO，Masiá M，Antequera P，et al.Comparison of combined nose-throat swabs with nasopharyngeal aspirates for detection of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus by real-time reverse transcriptase PCR[J].J Clin Microbiol，2010，48（10）：3492-3495.
[11] 张欣，闫惠平，马胤雪，等.不同方法检测流行性感冒样病例鼻咽和口咽拭子标本诊断甲型流行性感冒的评价[J].中华传染病杂志，2011，29（3）：154-157.
[12] 刘铮，孙明波，高菁霞，等. 低血清培养 Vero 细胞和流感病毒条件的优化[J].中国生物制品学杂志，2009，22（6）：593-595.
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[15] 卢勇，宋绍辉，蔡玮，等. ELISA 法检测 H3N2 亚型流感病毒 Vero 细胞适应株[J].现代生物医学进展，2013，13（10）：1811-1815.
（收稿日期：2015-04-29）