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摘要
桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害，建立准确、有效的桉树焦枯病的PCR快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。试验以桉树焦枯病原菌（Calonectria morganii） DNA为模板，分别以ITS和factor 1alpha序列为靶区域，针对Calonectria属和C.morganii设计了CYS1/CYS2和EFS1/EFA1两对特异性引物，建立了基于属和种的双重PCR快速检测技术。利用引物CYS1/CYS2可以从全部Calonectria属的供试菌株中扩增出一条351 bp大小的条带，单独用特异性引物EFS1/EFA1进行PCR扩增，仅病原菌扩增出197 bp的条带，同时使用2对引物时，病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度为53 ℃时，DNA灵敏度检测限度达到450 fg/μL。野外田间时效检测结果显示，该体系能准确检测出不同发病程度桉树组织上的病原菌，完全符合田间检测的要求。这是关于桉树焦枯病快速检测的首次报道。
关键词
桉树焦枯病；桉树焦枯病原菌；快速检测；PCR扩增
中图分类号：
S 432.44
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.019
Abstract
Eucalyptus dieback is the primary threat to the growth of eucalyptus. It is necessary to establish an accurate and effective PCR rapid detection technique for the early diagnosis of this disease. The duplex PCR technique， for rapid detection of genera and species of eucalyptus dieback disease pathogen was established with the total DNA as templates， and two pairs of specific primers （CYS1/CYS2 and EFS1/EFA1） for Calonectria de Not and C.morganii based on their ITS sequence and factor 1alpha gene were designed， respectively. The results showed that all tested strains belonging to Calonectria genera were amplified a product of 351 bp using primers CYS1/CYS2， while only C.morganii strains were amplified a product of 197 bp using primers EFS1/EFA1， and the duplex PCR with these two pairs of primers could amplify the two products. Furthermore， at the annealing temperature of 53 ℃， the minimum amount of detected DNA was 450 fg/μL. The infected eucalyptus tissue with different levels could be accurately detected by the duplex PCR technique， indicating that the duplex PCR technique fits entirely in the field test. This was the first report about the rapid detection technique on eucalyptus dieback caused by C.morganii.
Key words
eucalyptus dieback；Calonectria morganii；rapid detection；PCR amplification
桉树具有生长周期短、易存活、适生范围广、轮伐期短、用途多样化等优点，在我国秦岭淮河以南地区被大规模的引种和栽培，尤其以四川、云南、广东、广西、福建、湖南、贵州为主要栽培区[1]。国内外目前对桉树病害的报道较多，主要以桉树花斑病（Aureobasidium sp.）[2]、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）[3]、紫斑病（Septoria mortarlensis）[4]、灰霉病（Botrytis cinerea）[5]和桉树焦枯病[6]等叶部真菌性病害发生较为普遍，其中由丽赤壳属（Calonectriade Not）真菌引起的桉树焦枯病危害最为严重，分布最广泛[5]。桉树焦枯病作为一种世界性病害，已成为威胁桉树的首要病害。桉树焦枯病主要发生在桉树苗木和4年生以下幼树上。受焦枯病病原菌侵染后，轻者出现桉树植株叶片脱落，苗圃与幼林落叶、枯梢、枝条萎蔫等症状；重者则会出现感病苗木叶片全部脱落、顶枯、植株枝条全部枯死等现象[7]。在我国引起桉树焦枯病的丽赤壳属真菌主要为C.quinqueseptata和C.morganii，而C.morganii主要分布在我国西南地区。鉴于该病害的严重性及分布的局部性，原林业部于1996年1月5日把桉树焦枯病列入国内森林植物检疫对象[8]。 目前，国内外对桉树焦枯病菌的研究主要集中在病原菌形态学鉴定、分类、生物学特性、遗传性状、化学防治等方面，对于桉树焦枯病菌的快速检测暂无报道。因此，建立快速有效的分子生物学检测手段具有重要意义。Batuman 等[9]、Henriquez 等[10]、Deng 等[11]分别利用PCR以及基于PCR的快速检测技术对番茄褪绿病毒（Tomato chlorotic spot virus）、 菜豆根腐病（Fusarium cuneirostrum）和甘薯褪绿斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus）进行了有效的前期判断。本文以引起四川桉树焦枯病的病原菌（Calonectria morganii）为对象，建立了基于丽赤壳属（Calonectria）真菌以及Calonectria morganii病原菌的快速检测技术，并成功应用于田间不同发病程度桉树中病原的检测，为桉树焦枯病的早期诊断和提前防治提供重要的技术支持。
1材料与方法
1.1供试菌株及菌丝的收集
试验所用供试菌株名称、寄主、来源、数量详见表1，其中10号参试菌株的属名代表丽赤壳属（Calonectria）的无性阶段。将供试菌分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上，于28 ℃下培养7 d后用打孔器在菌落2/3边缘处打孔，制备直径为5 mm大小的菌饼，分别转接至瓶装量为200 mL的马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）的三角瓶中，置于28 ℃摇床，140 r/min，振荡培养8 d。用灭菌纱布过滤菌丝体，收集菌丝，灭菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥，存入已灭菌EP管中，-20 ℃保存备用。
1.2供试菌株DNA提取
供试菌株DNA的提取：菌丝基因组DNA的提取参照韩振云等[12]的方法。取30 mg冷冻干燥的菌丝于研钵中，加液氮后迅速研磨，至菌丝呈白色粉末状后快速转移至2 mL离心管中，加1 mL预热的裂解缓冲液混合均匀，置于65 ℃水浴锅中保温1 h左右；12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1 （体积比）混合有机溶剂，于12 000 r/min，4 ℃再次离心10 min，后取上清液；重复上述步骤2次；最后加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3 mol/L的醋酸钠溶液，-20 ℃沉淀 1 h 后于12 000 r/min，4 ℃再次离心10 min，弃上清液；75%的乙醇冲洗3次，待晾干后加入25 μL dd H2O溶解沉淀；加入100 μL TE （10 mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA）溶解DNA；吸取5 μL DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20 ℃冰箱备用。
样品组织DNA的提取：在焦枯病发病期从桉树栽培园区内采集健康和发病的叶片组织，用刀切成2 cm×2 cm大小的样块，75%乙醇消毒后用蒸馏水冲洗3次，晾干，称取100 mg已处理过的新鲜发病叶片置于研钵中用液氮研磨成粉末，进行DNA的提取，后续提取步骤同上。
1.3Calonectria属ITS区特异性引物设计与合成
利用真菌rDNA基因ITS区通用引物ITS1 （5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）对Calonectria属真菌进行PCR扩增，扩增体系（50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，10 mmol/L的引物ITS1/ITS4各1.5 μL，5 U/μL Taq酶 0.3 μL，模板DNA 4.0 μL，加灭菌ddH2O补足体积至50 μL，同时以加ddH2O代替DNA模板组做阴性对照。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。反应结束后，取5 μL样品于1.5%琼脂糖凝胶中电泳30 min （100 V），经EB染色后，在凝胶成像系统上观察并拍照。
PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GenBank中已知Calonectria属菌株的ITS序列，比对后利用软件Primer Premier 6.0，在Calonectria属真菌ITS保守区内进行该属特异性引物设计，通过基因库BLAST比对验证引物的特异性。引物合成委托上海生工有限公司完成。合成的引物序列为：CYS1 5′CCAGAGGACCCAACAAAC3′；CYS2 5′CCAGAGCGAGGTGTATTAC3′。目的片段扩增大小为351 bp。
1.4Calonectria morganii factor 1alpha （tef1）区特异性引物的设计与合成
利用Calonectria属真菌factor 1alpha （tef1）区基因通用引物，EF1728F （5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）和EF2[5′GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT3′]对C.morganii进行常规PCR扩增。PCR扩增体系 （50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL， MgCl2 3 μL， 10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，EF1728F （10 mmol/μL） 1.5 μL，EF2 （10 mmol/μL） 1.5 μL， Taq聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，ddH2O 33.2 μL，模板DNA 4.0 μL。PCR反应条件：94 ℃热启动 5 min；94 ℃变性 40 s；56 ℃退火 40 s；72 ℃延伸45 s；循环32次；72 ℃延伸10 min。 PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GenBank中已知Calonectria属菌株的factor 1alpha （tef1）基因序列，比对后利用软件Primer Premier 6.0进行C.morganii factor 1alpha （tef1）保守区域内的特异性引物设计，通过基因库BLAST比对验证引物的特异性。引物的合成委托上海生工有限公司完成。合成引物序列为：EFS1 5′GCAAGAGTCGGATGGAAT3′；EFA1 5′TTGATTGACACTGTGCTAAC3′，目的片段扩增大小为197 bp。
1.5特异性引物的验证
1.5.1Calonectria属通用引物的特异性验证
用1.3中设计合成的引物CYS1/CYS2对参试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性。反应体系和反应程序同1.3。
1.5.2Calonectria morganii特异性引物验证
用合成的桉树焦枯病菌（C.morganii）的特异引物EFS1/ EFA1对参试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性，反应体系和反应程序同1.4。
1.5.3双重PCR特异性引物验证
利用Calonectri属真菌特异性引物CYS1/CYS2和桉树焦枯病原菌（C.morganii）的factor 1alpha （tef1）基因的特异引物EFS1/EFA1 进行双重PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，CYS1（10 mmol/μL） 1.0 μL，CYS2（10 mmol/μL） 1.0 μL，EFS1 （10 mmol/μL） 1.0 μL，EFA1（10 mmol/μL） 1.0 μL，Tag聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，ddH2O 32.2 μL，基因组DNA提取液4.0 μL，组成反应混合液。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。
PCR产物的电泳检测：取5.0 μL PCR产物于含0.5 μg/mL EB 的 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，电压为9 V/cm、时间为30 min，在凝胶成像系统上检测并拍照。
1.6双重PCR灵敏度检测
将桉树焦枯病原菌（C.morganii）基因组DNA稀释为450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL浓度梯度，参照1.5.3的反应体系和条件进行双重PCR灵敏度检测。
1.7田间时效检测
2013年6-10月，在重庆桉树栽培园区内对不同发病程度的疑似桉树焦枯病进行随机采样，根据实际感病情况对园区内桉树焦枯病害的感病程度分级处理，共分为初期发病植株（0～25%）、中期发病植株（26%～50%）、严重发病植株（51%～75%）、具有典型症状植株（76%～100%）、健康植株（健康叶片）。按照发病组织DNA提取方法提取DNA，照1.5.3所述的方法进行双重PCR扩增，同时以加ddH2O代替DNA模板组和健康组做阴性对照。根据电泳检测结果判定桉树初期发病植株、中期发病植株、严重发病植株、具有典型症状植株、健康植株的样品中是否携带C.morganii致病菌。
2结果与分析
2.1ITS区引物的特异性
利用真菌rDNA基因ITS区通用引物对所有供试菌株进行扩增，反应结果见图1。结果显示：供试的Calonectria属全部菌株均可扩增出1条351 bp大小的特异性明亮条带，而对照组无条带。通过片段回收测序及与已发表的Calonectria属序列比对，其结果显示同源率为100%，证明特异性引物CYS1/CYS2可以从混合DNA样中准确地检测出Calonectria属病菌，准确率为100%，可以有效地用于Calonectria属菌株的检测。
2.2factor 1alpha （tef1） 区引物的特异性
桉树焦枯病病原菌（C.morganii）的特异性引物EFS1/ EFA1对全部供试菌扩增反应结果见图2。结果显示：1～6泳道上的C.morganii均可扩增出1条197 bp大小的特异性明亮条带，而对照组无条带。通过片段回收测序及与已发表的C.morganii的factor 1alpha （tef1）基因序列比对，其结果显示同源率为100%，证明特异性引物EFS1/EFA1可以从混合DNA样品中准确地检测出桉树焦枯病病原菌（C.morganii），准确率为100%。表明该引物用于桉树焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR扩增检测获得成功。
2.3双重PCR引物的特异性
双重PCR扩增反应结果见图3。结果显示：1～6泳道上的桉树焦枯病菌均可扩增出2条明亮的特异性条带，1条197 bp，1条351 bp，而Calonectria属的参试菌有且仅扩增出1条351 bp大小的明亮条带，而对照组无条带。因此，特异性引物CYS1/CYS2和EFS1/EFA1双重PCR可用于桉树焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR特异扩增。
2.4双重PCR灵敏度检测
利用引物CYS1/CYS2和EFS1/EFA1组合成双引物扩增桉树焦枯病原菌（C.morganii），其灵敏度测定结果（图4）表明，双重PCR具有较高检测灵敏度，可达到450 fg/μL，完全符合田间检测的要求。
2.5野外田间时效性检测 利用双重PCR扩增桉树初期发病植株、中期发病植株、严重发病植株、具有典型症状植株、健康植株的样品DNA，经电泳检测扩增结果表明：具有典型症状植株、严重发病植株、中期发病植株、初期发病植株均可以扩增得到分子量为197 bp和351 bp的2个片段，则可判定所测植株组织样品中存在桉树焦枯病原菌（C.morganii）（图5），而部分初期发病植株样品中没有扩增到条带，推测其所携带的目标病菌量未达到双重PCR灵敏度检测的极限。健康植株和阴性对照均没有扩增出条带，说明本试验不存在污染，具有可靠性。
3结论与讨论
桉树焦枯病作为一种世界性病害，越来越多地受到人们的重视。加强病害的早期诊断是降低重大病害损失的有效手段。传统病害的诊断方法主要以形态学及生理生化指标鉴定为主，该方法不仅费时费力、往往准确度较低，而且对鉴定者具有很高的专业知识要求，此外，肉眼鉴定病害的过程中会受到多种因素干扰，如分离培养的病原菌是否纯化、培养条件的影响、生理指标的不稳定性等，因此基于传统方法检测病害在一定程度上存在弊端。PCR及基于PCR的快速诊断技术在林业病害上的应用弥补了传统检测的不足，同时，较高的准确性、精确性、时效性使得林业上多种重要病害的早期诊断成为可能，例如：松材线虫病[13]、杨树溃疡病[14]、桉树青枯病[15]等。目前，对于桉树焦枯病的诊断仍停留在传统形态学检测上，因此建立桉树焦枯病的快速检测技术十分必要。
国内外大量学者研究证实，桉树焦枯病是由多种真菌共同引起的病害，其中Calonectria属的C.morganii是主要致病菌[1617]。Crous等[1819]发现C.morganii、Cylindrocladium clavatum（有性阶段为Calonectria属）、Calonectria colhounii均是桉树焦枯病的致病菌，区别在于其致病力的不同；在印度，侵染桉树导致焦枯病的Calonectria属真菌有十几种，主要以C.quinqueseptata（无性阶段为Cylindrocladium quinqueseptatum）和C.morganii为代表；在阿根廷、巴西、印度、日本、新西兰C.morganii是主要致病菌；在中国目前已发现的引起桉树焦枯病的真菌也有十几种，主要以C.morganii、C.ilicicola、C.quinqueseptata、 Cylindrocladium clavatum造成的危害较为严重，其中C.morganii和C.quinqueseptata 为我国林业病害的检疫对象[20]。前期研究发现，在四川、广西、福建等地引起桉树焦枯病的主要致病菌为C.morganii，因此，建立基于Calonectria属真菌以及C.morganii病原菌的快速检测对桉树焦枯病的前期诊断十分必要。
双重PCR检测是在常规PCR检测的基础上发展而来的，它主要是以相同或不同的区域作为靶基因，进行两对特异性引物的设计，以改善常规PCR灵敏度低和易发生非特异性的缺点[21]。随着PCR检测技术的不断完善，相信双重PCR检测技术在多种林木病害上的应用也将越来越普遍。同源性高的靶基因序列是检测病害的前提保障，而特异性极强的保守序列是快速检测单一种菌株体系构建成功的关键因子，Calonectria属真菌在其ITS序列上同源性较高，可达到99%，C.morganii病原菌在factor 1alpha基因上保守性极强，因此选择两者作为靶序列是试验成功的理论基础。本试验基于C.morganii病原菌的ITS和factor 1alpha基于序列，分别建立了Calonectria属真菌和桉树焦枯病菌（C.morganii）的特异性检测体系，并进行了两对引物共同体系的优化和建立，为以Calonectria属真菌和C.morganii引起的桉树焦枯病害早期诊断奠定了重要的理论依据，同时有关基于属与种特异性不同而进行靶序列设计引物的双重PCR检测技术在国内属于首次报道。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害，建立准确、有效的桉树焦枯病的PCR快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。试验以桉树焦枯病原菌（Calonectria morganii） DNA为模板，分别以ITS和factor 1alpha序列为靶区域，针对Calonectria属和C.morganii设计了CYS1/CYS2和EFS1/EFA1两对特异性引物，建立了基于属和种的双重PCR快速检测技术。利用引物CYS1/CYS2可以从全部Calonectria属的供试菌株中扩增出一条351 bp大小的条带，单独用特异性引物EFS1/EFA1进行PCR扩增，仅病原菌扩增出197 bp的条带，同时使用2对引物时，病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度为53 ℃时，DNA灵敏度检测限度达到450 fg/μL。野外田间时效检测结果显示，该体系能准确检测出不同发病程度桉树组织上的病原菌，完全符合田间检测的要求。这是关于桉树焦枯病快速检测的首次报道。
关键词
桉树焦枯病；桉树焦枯病原菌；快速检测；PCR扩增
中图分类号：
S 432.44
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.019
Abstract
Eucalyptus dieback is the primary threat to the growth of eucalyptus. It is necessary to establish an accurate and effective PCR rapid detection technique for the early diagnosis of this disease. The duplex PCR technique， for rapid detection of genera and species of eucalyptus dieback disease pathogen was established with the total DNA as templates， and two pairs of specific primers （CYS1/CYS2 and EFS1/EFA1） for Calonectria de Not and C.morganii based on their ITS sequence and factor 1alpha gene were designed， respectively. The results showed that all tested strains belonging to Calonectria genera were amplified a product of 351 bp using primers CYS1/CYS2， while only C.morganii strains were amplified a product of 197 bp using primers EFS1/EFA1， and the duplex PCR with these two pairs of primers could amplify the two products. Furthermore， at the annealing temperature of 53 ℃， the minimum amount of detected DNA was 450 fg/μL. The infected eucalyptus tissue with different levels could be accurately detected by the duplex PCR technique， indicating that the duplex PCR technique fits entirely in the field test. This was the first report about the rapid detection technique on eucalyptus dieback caused by C.morganii.
Key words
eucalyptus dieback；Calonectria morganii；rapid detection；PCR amplification
桉树具有生长周期短、易存活、适生范围广、轮伐期短、用途多样化等优点，在我国秦岭淮河以南地区被大规模的引种和栽培，尤其以四川、云南、广东、广西、福建、湖南、贵州为主要栽培区[1]。国内外目前对桉树病害的报道较多，主要以桉树花斑病（Aureobasidium sp.）[2]、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）[3]、紫斑病（Septoria mortarlensis）[4]、灰霉病（Botrytis cinerea）[5]和桉树焦枯病[6]等叶部真菌性病害发生较为普遍，其中由丽赤壳属（Calonectriade Not）真菌引起的桉树焦枯病危害最为严重，分布最广泛[5]。桉树焦枯病作为一种世界性病害，已成为威胁桉树的首要病害。桉树焦枯病主要发生在桉树苗木和4年生以下幼树上。受焦枯病病原菌侵染后，轻者出现桉树植株叶片脱落，苗圃与幼林落叶、枯梢、枝条萎蔫等症状；重者则会出现感病苗木叶片全部脱落、顶枯、植株枝条全部枯死等现象[7]。在我国引起桉树焦枯病的丽赤壳属真菌主要为C.quinqueseptata和C.morganii，而C.morganii主要分布在我国西南地区。鉴于该病害的严重性及分布的局部性，原林业部于1996年1月5日把桉树焦枯病列入国内森林植物检疫对象[8]。 目前，国内外对桉树焦枯病菌的研究主要集中在病原菌形态学鉴定、分类、生物学特性、遗传性状、化学防治等方面，对于桉树焦枯病菌的快速检测暂无报道。因此，建立快速有效的分子生物学检测手段具有重要意义。Batuman 等[9]、Henriquez 等[10]、Deng 等[11]分别利用PCR以及基于PCR的快速检测技术对番茄褪绿病毒（Tomato chlorotic spot virus）、 菜豆根腐病（Fusarium cuneirostrum）和甘薯褪绿斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus）进行了有效的前期判断。本文以引起四川桉树焦枯病的病原菌（Calonectria morganii）为对象，建立了基于丽赤壳属（Calonectria）真菌以及Calonectria morganii病原菌的快速检测技术，并成功应用于田间不同发病程度桉树中病原的检测，为桉树焦枯病的早期诊断和提前防治提供重要的技术支持。
1材料与方法
1.1供试菌株及菌丝的收集
试验所用供试菌株名称、寄主、来源、数量详见表1，其中10号参试菌株的属名代表丽赤壳属（Calonectria）的无性阶段。将供试菌分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上，于28 ℃下培养7 d后用打孔器在菌落2/3边缘处打孔，制备直径为5 mm大小的菌饼，分别转接至瓶装量为200 mL的马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）的三角瓶中，置于28 ℃摇床，140 r/min，振荡培养8 d。用灭菌纱布过滤菌丝体，收集菌丝，灭菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥，存入已灭菌EP管中，-20 ℃保存备用。
1.2供试菌株DNA提取
供试菌株DNA的提取：菌丝基因组DNA的提取参照韩振云等[12]的方法。取30 mg冷冻干燥的菌丝于研钵中，加液氮后迅速研磨，至菌丝呈白色粉末状后快速转移至2 mL离心管中，加1 mL预热的裂解缓冲液混合均匀，置于65 ℃水浴锅中保温1 h左右；12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1 （体积比）混合有机溶剂，于12 000 r/min，4 ℃再次离心10 min，后取上清液；重复上述步骤2次；最后加入2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积3 mol/L的醋酸钠溶液，-20 ℃沉淀 1 h 后于12 000 r/min，4 ℃再次离心10 min，弃上清液；75%的乙醇冲洗3次，待晾干后加入25 μL dd H2O溶解沉淀；加入100 μL TE （10 mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA）溶解DNA；吸取5 μL DNA溶液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，其余DNA样品置于-20 ℃冰箱备用。
样品组织DNA的提取：在焦枯病发病期从桉树栽培园区内采集健康和发病的叶片组织，用刀切成2 cm×2 cm大小的样块，75%乙醇消毒后用蒸馏水冲洗3次，晾干，称取100 mg已处理过的新鲜发病叶片置于研钵中用液氮研磨成粉末，进行DNA的提取，后续提取步骤同上。
1.3Calonectria属ITS区特异性引物设计与合成
利用真菌rDNA基因ITS区通用引物ITS1 （5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）对Calonectria属真菌进行PCR扩增，扩增体系（50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，10 mmol/L的引物ITS1/ITS4各1.5 μL，5 U/μL Taq酶 0.3 μL，模板DNA 4.0 μL，加灭菌ddH2O补足体积至50 μL，同时以加ddH2O代替DNA模板组做阴性对照。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。反应结束后，取5 μL样品于1.5%琼脂糖凝胶中电泳30 min （100 V），经EB染色后，在凝胶成像系统上观察并拍照。
PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GenBank中已知Calonectria属菌株的ITS序列，比对后利用软件Primer Premier 6.0，在Calonectria属真菌ITS保守区内进行该属特异性引物设计，通过基因库BLAST比对验证引物的特异性。引物合成委托上海生工有限公司完成。合成的引物序列为：CYS1 5′CCAGAGGACCCAACAAAC3′；CYS2 5′CCAGAGCGAGGTGTATTAC3′。目的片段扩增大小为351 bp。
1.4Calonectria morganii factor 1alpha （tef1）区特异性引物的设计与合成
利用Calonectria属真菌factor 1alpha （tef1）区基因通用引物，EF1728F （5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）和EF2[5′GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT3′]对C.morganii进行常规PCR扩增。PCR扩增体系 （50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL， MgCl2 3 μL， 10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，EF1728F （10 mmol/μL） 1.5 μL，EF2 （10 mmol/μL） 1.5 μL， Taq聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，ddH2O 33.2 μL，模板DNA 4.0 μL。PCR反应条件：94 ℃热启动 5 min；94 ℃变性 40 s；56 ℃退火 40 s；72 ℃延伸45 s；循环32次；72 ℃延伸10 min。 PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。根据测序结果，结合GenBank中已知Calonectria属菌株的factor 1alpha （tef1）基因序列，比对后利用软件Primer Premier 6.0进行C.morganii factor 1alpha （tef1）保守区域内的特异性引物设计，通过基因库BLAST比对验证引物的特异性。引物的合成委托上海生工有限公司完成。合成引物序列为：EFS1 5′GCAAGAGTCGGATGGAAT3′；EFA1 5′TTGATTGACACTGTGCTAAC3′，目的片段扩增大小为197 bp。
1.5特异性引物的验证
1.5.1Calonectria属通用引物的特异性验证
用1.3中设计合成的引物CYS1/CYS2对参试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性。反应体系和反应程序同1.3。
1.5.2Calonectria morganii特异性引物验证
用合成的桉树焦枯病菌（C.morganii）的特异引物EFS1/ EFA1对参试菌株的基因组DNA进行扩增，检测其特异性，反应体系和反应程序同1.4。
1.5.3双重PCR特异性引物验证
利用Calonectri属真菌特异性引物CYS1/CYS2和桉树焦枯病原菌（C.morganii）的factor 1alpha （tef1）基因的特异引物EFS1/EFA1 进行双重PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：10×PCR buffer 5.0 μL，MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，CYS1（10 mmol/μL） 1.0 μL，CYS2（10 mmol/μL） 1.0 μL，EFS1 （10 mmol/μL） 1.0 μL，EFA1（10 mmol/μL） 1.0 μL，Tag聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，ddH2O 32.2 μL，基因组DNA提取液4.0 μL，组成反应混合液。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。
PCR产物的电泳检测：取5.0 μL PCR产物于含0.5 μg/mL EB 的 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，电压为9 V/cm、时间为30 min，在凝胶成像系统上检测并拍照。
1.6双重PCR灵敏度检测
将桉树焦枯病原菌（C.morganii）基因组DNA稀释为450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL浓度梯度，参照1.5.3的反应体系和条件进行双重PCR灵敏度检测。
1.7田间时效检测
2013年6-10月，在重庆桉树栽培园区内对不同发病程度的疑似桉树焦枯病进行随机采样，根据实际感病情况对园区内桉树焦枯病害的感病程度分级处理，共分为初期发病植株（0～25%）、中期发病植株（26%～50%）、严重发病植株（51%～75%）、具有典型症状植株（76%～100%）、健康植株（健康叶片）。按照发病组织DNA提取方法提取DNA，照1.5.3所述的方法进行双重PCR扩增，同时以加ddH2O代替DNA模板组和健康组做阴性对照。根据电泳检测结果判定桉树初期发病植株、中期发病植株、严重发病植株、具有典型症状植株、健康植株的样品中是否携带C.morganii致病菌。
2结果与分析
2.1ITS区引物的特异性
利用真菌rDNA基因ITS区通用引物对所有供试菌株进行扩增，反应结果见图1。结果显示：供试的Calonectria属全部菌株均可扩增出1条351 bp大小的特异性明亮条带，而对照组无条带。通过片段回收测序及与已发表的Calonectria属序列比对，其结果显示同源率为100%，证明特异性引物CYS1/CYS2可以从混合DNA样中准确地检测出Calonectria属病菌，准确率为100%，可以有效地用于Calonectria属菌株的检测。
2.2factor 1alpha （tef1） 区引物的特异性
桉树焦枯病病原菌（C.morganii）的特异性引物EFS1/ EFA1对全部供试菌扩增反应结果见图2。结果显示：1～6泳道上的C.morganii均可扩增出1条197 bp大小的特异性明亮条带，而对照组无条带。通过片段回收测序及与已发表的C.morganii的factor 1alpha （tef1）基因序列比对，其结果显示同源率为100%，证明特异性引物EFS1/EFA1可以从混合DNA样品中准确地检测出桉树焦枯病病原菌（C.morganii），准确率为100%。表明该引物用于桉树焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR扩增检测获得成功。
2.3双重PCR引物的特异性
双重PCR扩增反应结果见图3。结果显示：1～6泳道上的桉树焦枯病菌均可扩增出2条明亮的特异性条带，1条197 bp，1条351 bp，而Calonectria属的参试菌有且仅扩增出1条351 bp大小的明亮条带，而对照组无条带。因此，特异性引物CYS1/CYS2和EFS1/EFA1双重PCR可用于桉树焦枯病原菌（C.morganii）病害的PCR特异扩增。
2.4双重PCR灵敏度检测
利用引物CYS1/CYS2和EFS1/EFA1组合成双引物扩增桉树焦枯病原菌（C.morganii），其灵敏度测定结果（图4）表明，双重PCR具有较高检测灵敏度，可达到450 fg/μL，完全符合田间检测的要求。
2.5野外田间时效性检测 利用双重PCR扩增桉树初期发病植株、中期发病植株、严重发病植株、具有典型症状植株、健康植株的样品DNA，经电泳检测扩增结果表明：具有典型症状植株、严重发病植株、中期发病植株、初期发病植株均可以扩增得到分子量为197 bp和351 bp的2个片段，则可判定所测植株组织样品中存在桉树焦枯病原菌（C.morganii）（图5），而部分初期发病植株样品中没有扩增到条带，推测其所携带的目标病菌量未达到双重PCR灵敏度检测的极限。健康植株和阴性对照均没有扩增出条带，说明本试验不存在污染，具有可靠性。
3结论与讨论
桉树焦枯病作为一种世界性病害，越来越多地受到人们的重视。加强病害的早期诊断是降低重大病害损失的有效手段。传统病害的诊断方法主要以形态学及生理生化指标鉴定为主，该方法不仅费时费力、往往准确度较低，而且对鉴定者具有很高的专业知识要求，此外，肉眼鉴定病害的过程中会受到多种因素干扰，如分离培养的病原菌是否纯化、培养条件的影响、生理指标的不稳定性等，因此基于传统方法检测病害在一定程度上存在弊端。PCR及基于PCR的快速诊断技术在林业病害上的应用弥补了传统检测的不足，同时，较高的准确性、精确性、时效性使得林业上多种重要病害的早期诊断成为可能，例如：松材线虫病[13]、杨树溃疡病[14]、桉树青枯病[15]等。目前，对于桉树焦枯病的诊断仍停留在传统形态学检测上，因此建立桉树焦枯病的快速检测技术十分必要。
国内外大量学者研究证实，桉树焦枯病是由多种真菌共同引起的病害，其中Calonectria属的C.morganii是主要致病菌[1617]。Crous等[1819]发现C.morganii、Cylindrocladium clavatum（有性阶段为Calonectria属）、Calonectria colhounii均是桉树焦枯病的致病菌，区别在于其致病力的不同；在印度，侵染桉树导致焦枯病的Calonectria属真菌有十几种，主要以C.quinqueseptata（无性阶段为Cylindrocladium quinqueseptatum）和C.morganii为代表；在阿根廷、巴西、印度、日本、新西兰C.morganii是主要致病菌；在中国目前已发现的引起桉树焦枯病的真菌也有十几种，主要以C.morganii、C.ilicicola、C.quinqueseptata、 Cylindrocladium clavatum造成的危害较为严重，其中C.morganii和C.quinqueseptata 为我国林业病害的检疫对象[20]。前期研究发现，在四川、广西、福建等地引起桉树焦枯病的主要致病菌为C.morganii，因此，建立基于Calonectria属真菌以及C.morganii病原菌的快速检测对桉树焦枯病的前期诊断十分必要。
双重PCR检测是在常规PCR检测的基础上发展而来的，它主要是以相同或不同的区域作为靶基因，进行两对特异性引物的设计，以改善常规PCR灵敏度低和易发生非特异性的缺点[21]。随着PCR检测技术的不断完善，相信双重PCR检测技术在多种林木病害上的应用也将越来越普遍。同源性高的靶基因序列是检测病害的前提保障，而特异性极强的保守序列是快速检测单一种菌株体系构建成功的关键因子，Calonectria属真菌在其ITS序列上同源性较高，可达到99%，C.morganii病原菌在factor 1alpha基因上保守性极强，因此选择两者作为靶序列是试验成功的理论基础。本试验基于C.morganii病原菌的ITS和factor 1alpha基于序列，分别建立了Calonectria属真菌和桉树焦枯病菌（C.morganii）的特异性检测体系，并进行了两对引物共同体系的优化和建立，为以Calonectria属真菌和C.morganii引起的桉树焦枯病害早期诊断奠定了重要的理论依据，同时有关基于属与种特异性不同而进行靶序列设计引物的双重PCR检测技术在国内属于首次报道。
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（责任编辑：杨明丽）