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【摘要】目的:构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型,即MCF-7细胞的PI3K-NC基因稳定转染组(对照组)/MCF-7细胞的PI3K-CA沉默组(沉默组),探讨PI3KCA基因对乳腺癌细胞MCF-7放射敏感性的影响。方法:通过脂质体转染方法,沉默乳腺癌细胞株的PI3KCA基因,构建MCF-7 PI3K-NC/MCF-7 PI3K-CARi细胞模型;通过实时定量PCR检测基因沉默的有效性;CCK-8方法检测细胞模型在0、2、4、6、8Gy射线照射下的细胞存活率,确定PI3K-CA基因沉默细胞的放射敏感性。结果:实时定量PCR结果证明细胞模型构建成功;在0、2、4、6、8Gy剂量下,对照组的细胞存活率分别为1.000±0.067、0.982±0.028、0.863±0.071、0.727±0.020、0.627±0.034。沉默组的细胞存活率分别为1.000±0.044、0.910±0.076、0.786±0.050、0.705±0.029、0.643±0.024; 结论:已成功构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型,沉默组细胞的放射敏感性高于对照组。说明沉默PI3K-CA基因能够提高乳腺癌细胞MCF-7的放射敏感性。
【关键词】乳腺癌;PI3KCA;放射敏感性。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率是女性肿瘤疾病首位。尤其在北美、西欧等发达国家,其发病率位居妇女恶性肿瘤之榜首, 大约每年出现1100000例乳腺癌新诊断病例。相比欧美国家来说,中国虽然是乳腺癌的低发国家, 但在过去的20 多年中,乳腺癌的发病率不断增加,目前临床上,对于乳腺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和内分泌治疗等。其中放疗是一种重要的治疗手段,特别是在保乳术的治疗方案中尤其如此。因此,研究乳腺癌细胞对放射治疗的敏感性对临床工作的诊治具有重要的意义。磷脂酞肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在细胞调节中有主要作用价值,现已发现PI3K和肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、浸润及转移等密切相关。P13K与ATM、ATR、DNA一PK等,均属于PIKs家族成员,它们在调节细胞放射敏感性中起着重要作用,现已证明PI3K和细胞放射阻抗性相关。相关文献显示,超过30%的乳腺癌患者存在PI3KCA的基因突变。Woenckhaus 等的研究也提示,阻断 PI3K 活性及其下游靶点 Akt 在恶性肿瘤中起重要作用,收获或扩增编码催化亚基 p110α 的 PI3KCA 基因,其表达增加与卵巢癌细胞系PI3K活性增加有关 ,且PI3KCA 扩增和 Ki-67 指数是早期肿瘤相关死亡的强力预测因子。
因此,笔者探索PI3K传导路径与乳腺癌细胞的放射敏感性的相关性。
材料与方法
1、主要试剂与仪器
PCR所需引物及RNAiso plus、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(荧光为SYBR Green I)试剂盒等均购自大连宝生物公司;慢病毒汤PI3KNC/PI3KCA购于上海吉玛制药技术有限公司; CCK-8试剂(日本同仁化学)。
2、方法
2.1 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7DMEM培养液(含10%FBS及青霉素与链霉素各100U/mL),37℃,5%CO2培养箱中培养,用0.25%胰酶(含0.2%EDTA)消化并传代,取对数生长期细胞进行实验。采用静止贴壁培养法,将筛选后的细胞进行扩增。细胞系生长在含15%小牛血清的培养基中,于37℃、5%CO2条件下置于培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况,及时进行细胞分瓶:在无菌超净工作台上操作,用吸管小心吸出旧培养液,加入适量消化液(胰蛋白酶液),最佳消化温度是37℃。2~3分钟后,置于倒置显微镜下观察消化细胞,当大部分细胞出现胞质回缩,细胞之间不再连接成片时,弃去胰蛋白酶液,加入培养液终止消化。用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液,将细胞悬液吸入10ml离心管中,平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心5分钟后,小心弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。将培养的MCF-7细胞分为PI3K-NC稳定转染组(简称对照组)和PI3K-CA沉默组(简称沉默组)。
2.2 慢病毒转染
用药物空筛,以确定MCF-7细胞对嘌呤霉素(puromycin,PM )的最小致死剂量。
转染试验前一天分别接种(3~5)×103 个MCF-7细胞于六孔培养板每孔中,所加DMEM培养基体积为2ml。分别对对照组和沉默组进行转染,病毒感染时细胞的融合度为30~50%,以保证有较好的实验结果。置于37℃,5%CO2过夜。转染前为细胞换液,吸去细胞上清,准备 2 个无菌的 EP 管,吸取 10ul 的 1×108TU/ml 的病毒(预先从-80℃取出在冰上融化)加入到第一个管子中,轻柔混匀,防止产生泡沫。置于37℃,5%CO2孵育。转然后8-12 小时观察细胞的状态,如果细胞状态与未感染细胞没有明显差异,说明慢病毒对细胞还未产生明显毒性作用,则需要继续培养,24 小时后更换为新鲜培养基。转染 48 小时后,在荧光显微镜下观察荧光表达情况。换液,加入药物嘌呤霉素(puromycin,PM )1.2μg(1.0μg/ml),继续置于37℃,5%CO2过夜,筛选出转染成功的细胞。
2.3 实时定量PCR检测自噬相关基因的表达
根据Genbank中序列设计特异性扩增引物,目的基因PI3KCA引物序列:5’-GGCTTGAAGAGTGTCGAAT-3’和5’-ATTCGACACTCTTCAAGCC-3’,内参GAPDH引物序列,5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’和5’-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3’,产物长度138 bp。收集细胞,用Trizol试剂提取总RNA。取500 ng总mRNA反转录为cDNA,cDNA 4倍稀释,利用SYBR染料法在PCR仪上扩增,建立PI3KCA的标准曲线,溶解曲线及扩增曲线。PCR反应条件:95℃预变性5s;95℃变性5s,60℃退火20s,共45个循环。以假照组为校正样本,按照△△Ct解析法对目的基因与管家基因进行相对定量。 2.4 照射条件
照射采用国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机,滤板0.5mmCu+1.0 mmAl。照射条件为靶皮距600mm,吸收剂量率0.41 Gy·min-1。
2.5 CCK8检测细胞药物敏感性
将处于对数生长期的对照组、沉默组的MCF-7细胞在0、2、4、6、8Gy剂量下照射,以4000个/孔数量接种于96孔板,每个剂量设三个复孔,电离辐射作用48h后检测细胞存活率。选择450nm波长,酶标仪测定各孔吸光值(A),细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%,设对照组细胞存活率为1,结果以±s表示。
2.6 统计学分析
不同剂量照射后,对照组和沉默组的MCF-7细胞存活率结果均用X±S表示,采用SPSS10.0进行统计学分析,组间比较采用t检验。
结果:
1.细胞模型荧光观察:
荧光显微镜下观察,可见细胞表达绿色荧光,转染成功的细胞会在荧光显微镜下观察到绿色荧光。荧光观察的结果如图1-(a)、(b)。图(a)、(b)分别是对照组和沉默组的MCF-7细胞的荧光照片。
(a)
(b)
图1:荧光显微镜检测对照组和沉默组
乳腺癌细胞转染效率图
Fig.1 Microscopic fluorescent image of mammary
gland cancer cells’ infection efficiency
2.转染后细胞中PI3KCA mRNA的表达
采用慢病毒转染方法,构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型,转染后用药物嘌呤霉素(puromycin,PM )筛选。提取总RNA并反转录为cDNA,模板10倍梯度稀释进行标准曲线的测定,采用实时定量PCR方法检测PI3KCA/NC基因的表达量,图2-(a)、(b)分别为PI3KCA基因的标准曲线与扩增曲线,扩增效率为108.2%,扩增较好。图3为对照组、沉默组MCF-7细胞的相量图,siRNA沉默组PI3KCA mRNA表达水平(0.54±0.12)与空白对照组(1.00±0.10)比较均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);表明模型构建成功。
(a)
(b)
图2 PI3KCA基因的标准曲线(a)与扩增曲线(b)
Fig. 2 Standard curve(a)and amplification curve(b) of PI3KCA in
MCF-7 cell
图3 对照组、沉默组的MCF-7细胞相量图
Fig. 3 relative quantity chart of PI3KCA in MCF-7 cell
3、细胞存活曲线
在0、2、4、6、8Gy剂量照射条件下,对照组和沉默组的细胞存活率如图4。
图4 对照组和沉默组的MCF-7细胞存活曲线
Fig 4 Control group and silent group of MCF - 7 cell survival curve
讨论:
PI3 K 通路的 异 常 与 乳 腺 癌 发 生 发 展 及 治 疗关系密切。有文献报道,超过 30% 的乳腺癌患者存在 PI3KCA 基 因 突 变。 PI3KCA基因位于染色体的3q26.3, 约含有3724bp。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,与v.Src和v.ras等癌基因的产物相关,且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K是生长因子受体超家族信号转导途径中的一个关键分子, 在促进细胞生长、抑制细胞凋亡、维持细胞生存等机制中具有重要作用。PI3 K基因突变在乳腺癌中多发生在第9及第20外显子上,其突变具有多样性。发生在PI3KCA催化区域突变基因如H1047R,H1047L,H1047Y和G1049R,而另一些发生在螺旋区域,如E545K,E542K等,Bachman通过对547例乳腺癌样本的分析发现,21.4%的样本中存在PI3KCA基因突变。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由短双链RNA(double-stranded RNA, dsDNA)所引起的序列特异性基因沉默,是真核生物体内一种阻断外源基因表达的自我防御体系,是dsDNA介导的,使与其互补的具有同源序列的单链RNA进行特异性降解的过程。自然界中,RNAi是生物抵御病毒及其它外来核酸侵入的机制。在乳腺癌基因治疗的体外研究中,RNA i技术针对不同的靶标均取得了较好的效果,其中包括ErbB-2基因、PPAR gamma1基因及HER2livin基因。RNA i技术具有很高的转录后沉默效率和序列特异性, 是基因治疗等研究领域的一个新的手段。本实验中,我们运用RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞株MCF-7的PI3KCA基因,利用药物嘌呤霉素的筛选作用得到PI3K-NC组稳定转染的MCF-7细胞和PI3K-CA沉默组的MCF-7细胞,经过照射和药物敏感性试验,我们可以得到如下结论:沉默组MCF-7细胞的放射敏感性与空白对照组细胞的放射敏感性相比有明显升高。因此本研究结果将在临床肿瘤的治疗方面提供新的方法和策略,为放疗的发展创造更多的提供新的策略契机。
参考文献:
[1] Leyland-Jones B.Trastuzumab.hopes and realities[J].LancetOncol2002;3(3):137.
[2] FARIN KAMANGAR, GRACA M.DORES, WILLIAM F.ANDERSON. Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five cont-inents: defining priorities to reduce cancer disparities indifferent geographic regions of the world[J]. Clin Oncol 2006;24(14):2137-2150.
[3] 郑莹,李德录,向咏梅等.上海市区乳腺癌流行现状及趋势分析.外科理论与实践,2001;6(4):219-221
[4] 唐静,祖旭宇.乳腺癌靶向治疗药物的研究进展.China Pharmacy 2011;22(41):3909-3911
[5] 李冰燕,童建,张增利.1,25二羟基维生素D3对乳腺癌细胞放射敏感性的影响. Basic Research 2007;27(8):620-627
[6] 傅深,孙宜,章青,邵雨卉,刘泰福.阻断PI3K-AKT通路对乳腺癌细胞放射敏感性影响的研究.中华放射肿瘤学杂志2006;1(6):467-470
[7] Bachman KE,Argani P,Samuels Y,et al.The PIK3CA gene is mutated with high frequency in human breast cancers[J].Cancer Biol Ther,2004,3(8):772-775.
[8] 陈芳芳. RNA干扰在肿瘤治疗上的研究进展[J].医学研究生学报,22(8):879-882
[9] Hammond SM. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA[J].NatRevGenet,2001,2(2):110-119.
[10] MillerMA.Sperm and oocyte isolation methods for biochemical and proteomic analysis[J].MethodsMolBio,l 2006,351:193-201.
【关键词】乳腺癌;PI3KCA;放射敏感性。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率是女性肿瘤疾病首位。尤其在北美、西欧等发达国家,其发病率位居妇女恶性肿瘤之榜首, 大约每年出现1100000例乳腺癌新诊断病例。相比欧美国家来说,中国虽然是乳腺癌的低发国家, 但在过去的20 多年中,乳腺癌的发病率不断增加,目前临床上,对于乳腺癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗和内分泌治疗等。其中放疗是一种重要的治疗手段,特别是在保乳术的治疗方案中尤其如此。因此,研究乳腺癌细胞对放射治疗的敏感性对临床工作的诊治具有重要的意义。磷脂酞肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在细胞调节中有主要作用价值,现已发现PI3K和肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、浸润及转移等密切相关。P13K与ATM、ATR、DNA一PK等,均属于PIKs家族成员,它们在调节细胞放射敏感性中起着重要作用,现已证明PI3K和细胞放射阻抗性相关。相关文献显示,超过30%的乳腺癌患者存在PI3KCA的基因突变。Woenckhaus 等的研究也提示,阻断 PI3K 活性及其下游靶点 Akt 在恶性肿瘤中起重要作用,收获或扩增编码催化亚基 p110α 的 PI3KCA 基因,其表达增加与卵巢癌细胞系PI3K活性增加有关 ,且PI3KCA 扩增和 Ki-67 指数是早期肿瘤相关死亡的强力预测因子。
因此,笔者探索PI3K传导路径与乳腺癌细胞的放射敏感性的相关性。
材料与方法
1、主要试剂与仪器
PCR所需引物及RNAiso plus、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(荧光为SYBR Green I)试剂盒等均购自大连宝生物公司;慢病毒汤PI3KNC/PI3KCA购于上海吉玛制药技术有限公司; CCK-8试剂(日本同仁化学)。
2、方法
2.1 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7DMEM培养液(含10%FBS及青霉素与链霉素各100U/mL),37℃,5%CO2培养箱中培养,用0.25%胰酶(含0.2%EDTA)消化并传代,取对数生长期细胞进行实验。采用静止贴壁培养法,将筛选后的细胞进行扩增。细胞系生长在含15%小牛血清的培养基中,于37℃、5%CO2条件下置于培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况,及时进行细胞分瓶:在无菌超净工作台上操作,用吸管小心吸出旧培养液,加入适量消化液(胰蛋白酶液),最佳消化温度是37℃。2~3分钟后,置于倒置显微镜下观察消化细胞,当大部分细胞出现胞质回缩,细胞之间不再连接成片时,弃去胰蛋白酶液,加入培养液终止消化。用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液,将细胞悬液吸入10ml离心管中,平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心5分钟后,小心弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。将培养的MCF-7细胞分为PI3K-NC稳定转染组(简称对照组)和PI3K-CA沉默组(简称沉默组)。
2.2 慢病毒转染
用药物空筛,以确定MCF-7细胞对嘌呤霉素(puromycin,PM )的最小致死剂量。
转染试验前一天分别接种(3~5)×103 个MCF-7细胞于六孔培养板每孔中,所加DMEM培养基体积为2ml。分别对对照组和沉默组进行转染,病毒感染时细胞的融合度为30~50%,以保证有较好的实验结果。置于37℃,5%CO2过夜。转染前为细胞换液,吸去细胞上清,准备 2 个无菌的 EP 管,吸取 10ul 的 1×108TU/ml 的病毒(预先从-80℃取出在冰上融化)加入到第一个管子中,轻柔混匀,防止产生泡沫。置于37℃,5%CO2孵育。转然后8-12 小时观察细胞的状态,如果细胞状态与未感染细胞没有明显差异,说明慢病毒对细胞还未产生明显毒性作用,则需要继续培养,24 小时后更换为新鲜培养基。转染 48 小时后,在荧光显微镜下观察荧光表达情况。换液,加入药物嘌呤霉素(puromycin,PM )1.2μg(1.0μg/ml),继续置于37℃,5%CO2过夜,筛选出转染成功的细胞。
2.3 实时定量PCR检测自噬相关基因的表达
根据Genbank中序列设计特异性扩增引物,目的基因PI3KCA引物序列:5’-GGCTTGAAGAGTGTCGAAT-3’和5’-ATTCGACACTCTTCAAGCC-3’,内参GAPDH引物序列,5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’和5’-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3’,产物长度138 bp。收集细胞,用Trizol试剂提取总RNA。取500 ng总mRNA反转录为cDNA,cDNA 4倍稀释,利用SYBR染料法在PCR仪上扩增,建立PI3KCA的标准曲线,溶解曲线及扩增曲线。PCR反应条件:95℃预变性5s;95℃变性5s,60℃退火20s,共45个循环。以假照组为校正样本,按照△△Ct解析法对目的基因与管家基因进行相对定量。 2.4 照射条件
照射采用国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机,滤板0.5mmCu+1.0 mmAl。照射条件为靶皮距600mm,吸收剂量率0.41 Gy·min-1。
2.5 CCK8检测细胞药物敏感性
将处于对数生长期的对照组、沉默组的MCF-7细胞在0、2、4、6、8Gy剂量下照射,以4000个/孔数量接种于96孔板,每个剂量设三个复孔,电离辐射作用48h后检测细胞存活率。选择450nm波长,酶标仪测定各孔吸光值(A),细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%,设对照组细胞存活率为1,结果以±s表示。
2.6 统计学分析
不同剂量照射后,对照组和沉默组的MCF-7细胞存活率结果均用X±S表示,采用SPSS10.0进行统计学分析,组间比较采用t检验。
结果:
1.细胞模型荧光观察:
荧光显微镜下观察,可见细胞表达绿色荧光,转染成功的细胞会在荧光显微镜下观察到绿色荧光。荧光观察的结果如图1-(a)、(b)。图(a)、(b)分别是对照组和沉默组的MCF-7细胞的荧光照片。
(a)
(b)
图1:荧光显微镜检测对照组和沉默组
乳腺癌细胞转染效率图
Fig.1 Microscopic fluorescent image of mammary
gland cancer cells’ infection efficiency
2.转染后细胞中PI3KCA mRNA的表达
采用慢病毒转染方法,构建MCF-7 PI3KNC/MCF-7 PI3KCARi细胞模型,转染后用药物嘌呤霉素(puromycin,PM )筛选。提取总RNA并反转录为cDNA,模板10倍梯度稀释进行标准曲线的测定,采用实时定量PCR方法检测PI3KCA/NC基因的表达量,图2-(a)、(b)分别为PI3KCA基因的标准曲线与扩增曲线,扩增效率为108.2%,扩增较好。图3为对照组、沉默组MCF-7细胞的相量图,siRNA沉默组PI3KCA mRNA表达水平(0.54±0.12)与空白对照组(1.00±0.10)比较均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);表明模型构建成功。
(a)
(b)
图2 PI3KCA基因的标准曲线(a)与扩增曲线(b)
Fig. 2 Standard curve(a)and amplification curve(b) of PI3KCA in
MCF-7 cell
图3 对照组、沉默组的MCF-7细胞相量图
Fig. 3 relative quantity chart of PI3KCA in MCF-7 cell
3、细胞存活曲线
在0、2、4、6、8Gy剂量照射条件下,对照组和沉默组的细胞存活率如图4。
图4 对照组和沉默组的MCF-7细胞存活曲线
Fig 4 Control group and silent group of MCF - 7 cell survival curve
讨论:
PI3 K 通路的 异 常 与 乳 腺 癌 发 生 发 展 及 治 疗关系密切。有文献报道,超过 30% 的乳腺癌患者存在 PI3KCA 基 因 突 变。 PI3KCA基因位于染色体的3q26.3, 约含有3724bp。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,与v.Src和v.ras等癌基因的产物相关,且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K是生长因子受体超家族信号转导途径中的一个关键分子, 在促进细胞生长、抑制细胞凋亡、维持细胞生存等机制中具有重要作用。PI3 K基因突变在乳腺癌中多发生在第9及第20外显子上,其突变具有多样性。发生在PI3KCA催化区域突变基因如H1047R,H1047L,H1047Y和G1049R,而另一些发生在螺旋区域,如E545K,E542K等,Bachman通过对547例乳腺癌样本的分析发现,21.4%的样本中存在PI3KCA基因突变。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由短双链RNA(double-stranded RNA, dsDNA)所引起的序列特异性基因沉默,是真核生物体内一种阻断外源基因表达的自我防御体系,是dsDNA介导的,使与其互补的具有同源序列的单链RNA进行特异性降解的过程。自然界中,RNAi是生物抵御病毒及其它外来核酸侵入的机制。在乳腺癌基因治疗的体外研究中,RNA i技术针对不同的靶标均取得了较好的效果,其中包括ErbB-2基因、PPAR gamma1基因及HER2livin基因。RNA i技术具有很高的转录后沉默效率和序列特异性, 是基因治疗等研究领域的一个新的手段。本实验中,我们运用RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞株MCF-7的PI3KCA基因,利用药物嘌呤霉素的筛选作用得到PI3K-NC组稳定转染的MCF-7细胞和PI3K-CA沉默组的MCF-7细胞,经过照射和药物敏感性试验,我们可以得到如下结论:沉默组MCF-7细胞的放射敏感性与空白对照组细胞的放射敏感性相比有明显升高。因此本研究结果将在临床肿瘤的治疗方面提供新的方法和策略,为放疗的发展创造更多的提供新的策略契机。
参考文献:
[1] Leyland-Jones B.Trastuzumab.hopes and realities[J].LancetOncol2002;3(3):137.
[2] FARIN KAMANGAR, GRACA M.DORES, WILLIAM F.ANDERSON. Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five cont-inents: defining priorities to reduce cancer disparities indifferent geographic regions of the world[J]. Clin Oncol 2006;24(14):2137-2150.
[3] 郑莹,李德录,向咏梅等.上海市区乳腺癌流行现状及趋势分析.外科理论与实践,2001;6(4):219-221
[4] 唐静,祖旭宇.乳腺癌靶向治疗药物的研究进展.China Pharmacy 2011;22(41):3909-3911
[5] 李冰燕,童建,张增利.1,25二羟基维生素D3对乳腺癌细胞放射敏感性的影响. Basic Research 2007;27(8):620-627
[6] 傅深,孙宜,章青,邵雨卉,刘泰福.阻断PI3K-AKT通路对乳腺癌细胞放射敏感性影响的研究.中华放射肿瘤学杂志2006;1(6):467-470
[7] Bachman KE,Argani P,Samuels Y,et al.The PIK3CA gene is mutated with high frequency in human breast cancers[J].Cancer Biol Ther,2004,3(8):772-775.
[8] 陈芳芳. RNA干扰在肿瘤治疗上的研究进展[J].医学研究生学报,22(8):879-882
[9] Hammond SM. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA[J].NatRevGenet,2001,2(2):110-119.
[10] MillerMA.Sperm and oocyte isolation methods for biochemical and proteomic analysis[J].MethodsMolBio,l 2006,351:193-201.