【摘 要】
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目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-Ⅰ,观察其在大肠埃希菌中的表达效率. 方法 以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接
【机 构】
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重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所,重庆,400016
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目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-Ⅰ,观察其在大肠埃希菌中的表达效率. 方法 以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-Ⅰ融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-Ⅰ并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定.重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物. 结果 基因拼接法获得1 289 bp的OprF-Ⅰ融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1 λT中.重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×103的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18％.Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白. 结论 成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-Ⅰ,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-Ⅰ融合蛋白,该蛋白具有反应原性.
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