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【摘要】目的分析探讨人参皂苷Rb1对人表皮黑素细胞黑素生成的影响及其作用机制。方法人表皮黑素细胞取自小儿包皮环切术标本，以第2-5代的细胞作为研究对象进行实验，采用MTT法对人黑素细胞增殖情况进行测定，而采用分光光度计法测定酪氨酸酶的多巴氧化酶活性，针对人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的影响进行分析评价。结果将25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L人参皂苷Rbl分别加入体外培养的人黑素细胞后，并且在作用72h后，发现三组黑素细胞存活率P>0.05，差异不明显，不具有统计学意义，而人表皮黑素细胞黑素的含量呈现浓度依赖性增加，经测定三组的含量分别为110.4%±5.7%、145.6%±3.6%、209.6%±10.3%。结论人参皂苷Rb1可促进正常人黑素细胞的黑素合成和酪氨酸酶活性。PKA/CREB/MITF/酪氨酸酶信号通路可能参与了人参皂苷Rb1的促黑素生成机制。
【关键词】人参皂甙Rb1；人表皮黑素细胞；黑素生长；影响；作用机制
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.762文章编号：1004-7484（2013）-07-4134-01
人参具有较强的药理活性，其发挥作用的活性物质主要为人参皂甙，其中，以Rbl的药理作用最为突出，人参皂甙Rb1是中药人参的主要有效成分，具有活性调节作用、安神、调和气血，曾被用于治疗白癜风等色素脱失性疾病；近年来，有关报道指出人参皂甙Rb1具有抗氧化、搞衰老、抗凋亡，促进神经纤维的形成，而黑素细胞与神经细胞同源，但是对于人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的作用机制却未曾报道。为此，本文取自小儿包皮环切术标本，以第2-5代的细胞作为研究对象进行实验，采用MTT法对人黑素细胞增殖情况进行测定，针对人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的影响进行分析评价，具体的结果报告如下：
1资料与方法
1.1一般资料小儿包皮环切术标本，取第2-5代的细胞作为实验研究对象。
1.2方法与指标人表皮黑素细胞取自小儿包皮环切术标本，以第2-5代的细胞作为研究对象进行实验，采用MTT法（四甲基偶氮唑兰比色法）对人黑素细胞增殖情况进行测定，而采用分光光度计法测定酪氨酸酶的多巴氧化酶活性，针对人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的影响进行分析评价。另外，对于黑素含量的测定则可以采用氢氧化钠裂解法，小眼畸形相关转录因子（MITF）的表达、黑素细胞酪氨酸酶以及CAMP应答元件结合蛋白（CREB）的磷酸化的具体情况和含量则可以采取免疫蛋白印记法进行测定，根据其所测定的结果，并设定一组溶剂对照组（不加入人参皂甙Rb1），全面分析其评价结果。
1.2.1黑素细胞活力测定用0.25%的胰酶消化处于对数生长期的黑素细胞，用M254黑素细胞培养基进行终止并将黑素细胞稀释，加入人参皂甙Rb1，继续培养4小时后，置于振荡器上低速震荡，对其细胞活性进行测定。
1.2.2黑素细胞黑素含量测定采用同样方法将黑素细胞稀释，再用酶标仪测定标本吸光度值，实验黑素含量用实验组减去对照组值即可。
1.3统计学分析采取SPSS13.0软件实施统计分析，其计量资料采用t检验，P<0.05有统计学意义。
2结果
将25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L人参皂苷Rbl分别加入体外培养的人黑素细胞后，并且在作用72h后，发现三组黑素细胞存活率P>0.05，差异不明显，不具有统计学意义，而人表皮黑素细胞黑素的含量呈现浓度依赖性增加，经测定三组的含量分别为110.4%±5.7%、145.6%±3.6%、209.6%±10.3%。根据本组结果研究显示：三组酪氨酸酶活性都相应的增加，具体的活性分别为112.4%±5.7%、156.6%±3.6%、221.6%±10.3%。
另外，在加入100μmol/L人参皂苷Rb1的溶液中，72h后该组的黑素细胞酪氨酸酶、MITF值显著提高，分别为219.2%±11.7%、309.6%±14.6%，同時，蛋白表达也显著提高，与溶剂对照组相比，P值均<0.01。
3讨论
人参具有较强的药理活性，其发挥作用的活性物质主要为人参皂甙，其中，以Rbl的药理作用最为突出。近年来，人们经过大量的研究发现，人参皂苷Rb1对体外培养的人黑素细胞黑素生成具有一定的影响作用，为此，本文通过实验来对Rbl的药理以及对黑素形成的影响和相关的作用机制进行了简单分析，通过实验研究发现：人参皂苷Rb1可促进正常人黑素细胞的黑素合成和酪氨酸酶活性，并且在人参皂苷Rb1促进黑素生成机制形成的过程中，CREB、PKA、MITF、酪氨酸酶信号通路都参与了了黑素的生成。如本组研究中，与溶剂对照组相比，CREB磷酸化现象明显提升，具体为311.5%±12.6%，P<0.01；而且，人表皮黑素细胞黑素的含量呈现浓度依赖性增加，三组酪氨酸酶活性都相应的增加，72h后该组的黑素细胞酪氨酸酶、MITF值显著提高。总之，人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长具有促进作用，而且随着浓度的增加，其促进作用也相应增加，并且，在作用过程中，CREB、PKA、MITF、酪氨酸酶也会参与其中，从而进一步促进黑素的生成。
参考文献
[1]黄英如，蒋电明，冼华，黄剑，陈增刚，王雷.人参皂甙Rb1对玻璃化保存坐骨神经异体移植后神经再生的影响[J].中国矫形外科杂志，2013，（04）：390-396.
[2]李伟秋，刘少辉，徐丹丹，方斌，林玲，陈玮莹.一种人表皮黑素细胞透射电镜观察方法[J].汕头大学医学院学报，2013，（01）：19-20+65.
[3]谢席胜，刘衡川，樊均明，李会娟.人参皂甙Rb1对转化生长因子-β1诱导的肾小管上皮细胞p47phox的表达及细胞外基质的影响[J].四川大学学报（医学版），2009，（01）：106-110.
[4]林茂，魏振东，张宝祥，张新军，涂彩霞.人参皂甙Rb1对黑素生成相关信号通路的影响[A].中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会.2012全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C].中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会，2012.1.
[5]许志威，蓝涛华，吴伟康，吴以岭.人参皂甙Rb1对高同型半胱氨酸诱导的内皮损伤及ghrelin多肽表达的影响[A].中华中医药学会、中国中西医结合学会.络病学基础与临床研究（5）[C].中华中医药学会、中国中西医结合学会，2009.5.
[6]问静，何侠，赵洪瑜，仇晓军，王燕，陈晓珏，季斌.高能X线和人参皂甙Rb_1对人脑胶质瘤细胞SHG-44的影响[J].肿瘤学杂志，2012，18（04）：266-269.
[7]胡立强.人参皂甙Rb_1对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D].中南大学，2010.
[8]黄飞.人参皂甙Rb1调节AQP4表达在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中作用的实验研究[D].吉林大学，2012.
[9]刘黎军，杨雷，肖建德，王大平.人参皂甙Rb1及Rg1对许旺细胞神经生长因子表达的影响（英文）[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（32）：6393-6396.
[10]吕梦捷，曾耀英，宋兵.人参皂甙Rb1对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬及细胞因子分泌的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，（03）：242-248.
【关键词】人参皂甙Rb1；人表皮黑素细胞；黑素生长；影响；作用机制
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.762文章编号：1004-7484（2013）-07-4134-01
人参具有较强的药理活性，其发挥作用的活性物质主要为人参皂甙，其中，以Rbl的药理作用最为突出，人参皂甙Rb1是中药人参的主要有效成分，具有活性调节作用、安神、调和气血，曾被用于治疗白癜风等色素脱失性疾病；近年来，有关报道指出人参皂甙Rb1具有抗氧化、搞衰老、抗凋亡，促进神经纤维的形成，而黑素细胞与神经细胞同源，但是对于人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的作用机制却未曾报道。为此，本文取自小儿包皮环切术标本，以第2-5代的细胞作为研究对象进行实验，采用MTT法对人黑素细胞增殖情况进行测定，针对人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的影响进行分析评价，具体的结果报告如下：
1资料与方法
1.1一般资料小儿包皮环切术标本，取第2-5代的细胞作为实验研究对象。
1.2方法与指标人表皮黑素细胞取自小儿包皮环切术标本，以第2-5代的细胞作为研究对象进行实验，采用MTT法（四甲基偶氮唑兰比色法）对人黑素细胞增殖情况进行测定，而采用分光光度计法测定酪氨酸酶的多巴氧化酶活性，针对人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长的影响进行分析评价。另外，对于黑素含量的测定则可以采用氢氧化钠裂解法，小眼畸形相关转录因子（MITF）的表达、黑素细胞酪氨酸酶以及CAMP应答元件结合蛋白（CREB）的磷酸化的具体情况和含量则可以采取免疫蛋白印记法进行测定，根据其所测定的结果，并设定一组溶剂对照组（不加入人参皂甙Rb1），全面分析其评价结果。
1.2.1黑素细胞活力测定用0.25%的胰酶消化处于对数生长期的黑素细胞，用M254黑素细胞培养基进行终止并将黑素细胞稀释，加入人参皂甙Rb1，继续培养4小时后，置于振荡器上低速震荡，对其细胞活性进行测定。
1.2.2黑素细胞黑素含量测定采用同样方法将黑素细胞稀释，再用酶标仪测定标本吸光度值，实验黑素含量用实验组减去对照组值即可。
1.3统计学分析采取SPSS13.0软件实施统计分析，其计量资料采用t检验，P<0.05有统计学意义。
2结果
将25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L人参皂苷Rbl分别加入体外培养的人黑素细胞后，并且在作用72h后，发现三组黑素细胞存活率P>0.05，差异不明显，不具有统计学意义，而人表皮黑素细胞黑素的含量呈现浓度依赖性增加，经测定三组的含量分别为110.4%±5.7%、145.6%±3.6%、209.6%±10.3%。根据本组结果研究显示：三组酪氨酸酶活性都相应的增加，具体的活性分别为112.4%±5.7%、156.6%±3.6%、221.6%±10.3%。
另外，在加入100μmol/L人参皂苷Rb1的溶液中，72h后该组的黑素细胞酪氨酸酶、MITF值显著提高，分别为219.2%±11.7%、309.6%±14.6%，同時，蛋白表达也显著提高，与溶剂对照组相比，P值均<0.01。
3讨论
人参具有较强的药理活性，其发挥作用的活性物质主要为人参皂甙，其中，以Rbl的药理作用最为突出。近年来，人们经过大量的研究发现，人参皂苷Rb1对体外培养的人黑素细胞黑素生成具有一定的影响作用，为此，本文通过实验来对Rbl的药理以及对黑素形成的影响和相关的作用机制进行了简单分析，通过实验研究发现：人参皂苷Rb1可促进正常人黑素细胞的黑素合成和酪氨酸酶活性，并且在人参皂苷Rb1促进黑素生成机制形成的过程中，CREB、PKA、MITF、酪氨酸酶信号通路都参与了了黑素的生成。如本组研究中，与溶剂对照组相比，CREB磷酸化现象明显提升，具体为311.5%±12.6%，P<0.01；而且，人表皮黑素细胞黑素的含量呈现浓度依赖性增加，三组酪氨酸酶活性都相应的增加，72h后该组的黑素细胞酪氨酸酶、MITF值显著提高。总之，人参皂甙Rb1对人表皮黑素细胞黑素生长具有促进作用，而且随着浓度的增加，其促进作用也相应增加，并且，在作用过程中，CREB、PKA、MITF、酪氨酸酶也会参与其中，从而进一步促进黑素的生成。
参考文献
[1]黄英如，蒋电明，冼华，黄剑，陈增刚，王雷.人参皂甙Rb1对玻璃化保存坐骨神经异体移植后神经再生的影响[J].中国矫形外科杂志，2013，（04）：390-396.
[2]李伟秋，刘少辉，徐丹丹，方斌，林玲，陈玮莹.一种人表皮黑素细胞透射电镜观察方法[J].汕头大学医学院学报，2013，（01）：19-20+65.
[3]谢席胜，刘衡川，樊均明，李会娟.人参皂甙Rb1对转化生长因子-β1诱导的肾小管上皮细胞p47phox的表达及细胞外基质的影响[J].四川大学学报（医学版），2009，（01）：106-110.
[4]林茂，魏振东，张宝祥，张新军，涂彩霞.人参皂甙Rb1对黑素生成相关信号通路的影响[A].中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会.2012全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C].中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会，2012.1.
[5]许志威，蓝涛华，吴伟康，吴以岭.人参皂甙Rb1对高同型半胱氨酸诱导的内皮损伤及ghrelin多肽表达的影响[A].中华中医药学会、中国中西医结合学会.络病学基础与临床研究（5）[C].中华中医药学会、中国中西医结合学会，2009.5.
[6]问静，何侠，赵洪瑜，仇晓军，王燕，陈晓珏，季斌.高能X线和人参皂甙Rb_1对人脑胶质瘤细胞SHG-44的影响[J].肿瘤学杂志，2012，18（04）：266-269.
[7]胡立强.人参皂甙Rb_1对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D].中南大学，2010.
[8]黄飞.人参皂甙Rb1调节AQP4表达在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中作用的实验研究[D].吉林大学，2012.
[9]刘黎军，杨雷，肖建德，王大平.人参皂甙Rb1及Rg1对许旺细胞神经生长因子表达的影响（英文）[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（32）：6393-6396.
[10]吕梦捷，曾耀英，宋兵.人参皂甙Rb1对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬及细胞因子分泌的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，（03）：242-248.