【摘 要】
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目的 构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖（ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dotsmorin,NMCM）水凝胶，通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤，并探讨相关机制。方法 取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光（ultraviolet,UV）交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点，两者混合后加入桑黄素溶液，在UV下照射交联，获得NMCM水凝胶，检测其缓
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金资助项目（LH2019H020）； 北京康盟慈善基金会医学科研发展基金项目（YXKY-HX2002）～～；
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目的 构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖（ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dotsmorin,NMCM）水凝胶，通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤，并探讨相关机制。方法 取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光（ultraviolet,UV）交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点，两者混合后加入桑黄素溶液，在UV下照射交联，获得NMCM水凝胶，检测其缓释性能。取关节置换患者自愿捐赠的正常及膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）软骨组织，分离培养软骨细胞并经甲苯胺蓝染色鉴定。取第3代KOA软骨细胞，首先分别与12.5、25.0、50.0μmol/L桑黄素及负载该浓度桑黄素的NMCM水凝胶混合培养，细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8,CCK-8）法检测上述浓度桑黄素及水凝胶对软骨细胞增殖的影响；然后与负载50μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶共培养，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白（collagen typeⅡ，COL-Ⅱ）水平、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯探针检测活性氧水平。取4周龄SD大鼠20只，构建右后肢膝关节软骨损伤模型，随机分为两组（n=10）；其中实验组软骨缺损处注射负载25μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶，对照组不作处理。术后4周，取标本micro-CT观察股骨髁软骨缺损修复情况，大体观察缺损部位并行国际软骨修复协会（ICRS）大体评分，番红-O固绿染色及COL-Ⅱ免疫组织化学染色观察软骨和软骨下骨并行ICRS组织学评分，Western blot以及实时荧光定量PCR检测软骨组织中TNF-α、NF-κB、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13,MMP-13）、COL-Ⅱ蛋白及mRNA表达。结果 实验成功构建负载不同浓度桑黄素的NMCM水凝胶，其短时间内药物释放速度较快，24 h后速度逐渐放缓，96 h时释放量接近于0，此时药物累积释放率达88%。浓度≤50μmol/L的桑黄素对软骨细胞无毒性作用，且在NMCM水凝胶干预下，软骨细胞增殖能力提高（P＜0.05）。NMCM水凝胶可提高KOA软骨细胞中COL-Ⅱ水平（P＜0.05），降低活性氧水平（P＜0.05），但尚未达正常水平（P＜0.05）。动物实验显示，实验组术后4周关节面粗糙，软骨缺损可见，但其周围有组织修复，关节间隙仍保持正常；对照组关节面更粗糙，软骨缺损未见组织修复。与对照组相比，实验组软骨细胞较多，COL-Ⅱ表达增强，ICRS大体及组织学评分均较高（P＜0.05）;MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相对表达量降低，COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 NMCM水凝胶能促进大鼠膝关节软骨细胞增殖、抑制软骨细胞分解代谢，抵抗氧化应激反应，保护软骨细胞，促进软骨修复。
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