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摘要：随着对宫颈癌发生机制的深入研究，基因的异常表达在宫颈癌形成过程中所起的重要作用已逐渐被人们了解。基因的异常表达的精确监测可为宫颈癌早期诊断和预后判断提供依据。通过对宫颈癌相关基因肿瘤标志物研究报道进行总结与分析，试图为进一步研究提供参考。目前，随着宫颈癌相关基因研究的不断深入，相关研究已取得一定进展，一些标志物也已经应用在临床诊断及疾病预后预判。
1.P53基因
除人乳头瘤病毒感染，遗传因素也是促使宫颈癌易患的一个重要因素，人类不同种群中P53基因72位密码子的精氨酸等位基因已经被报道是一个宫颈癌致患的危险因子。Ndiaye R等[2]研究了这一危险因子在塞内加尔人群中的多态性。通过个案对照试验，以30例宫颈癌患者为病例组，以93例未被诊断为宫颈癌女性为对照组，提取全血DNA，应用PCR-RFLP方法分析72位密码子的多态性，发现精氨酸等位基因与宫颈癌易感性的相关性不高（P=0.354）。此外，通过分析形态学损伤与精氨酸等位基因的相互关系，也发现精氨酸等位基因与宫颈癌易患敏感性之间关系也不紧密，研究表明P53作为基因标志物遗传因素是其重要影响因素之一。Hellberg D等[3]以128例浸入型宫颈癌组织为样本，随访10年以上，通过免疫组化法监测12种基因的表达情况，结合病理学特征与预后，确定LRIG1、LRIG2、p53、COX2 和 c-MYC这5个基因与预后分数高度相关，0-5分范围，0-1分10年死亡率低于5%，而4-5分达到70%。使用不同模型，可用于高敏感性和高特异性阳性、阴性预测。建立肿瘤标志物分数模型可以对临床病理学和临床参数进行早期预测，为调整治疗方案提供依据。
2.MicroRNA
MicroRNAs与很多影响肿瘤发展和转移的生物学通路相关，且可以作为多种肿瘤预后判断的标志物。Liang H等[4]以诊断为宫颈癌Ⅱ期302位患者的宫颈癌组织为样本，应用qRT-PCR技术监测miR215的表达情况，Cox回归分析确定miR-215表达临界值，从而研究miR215在宫颈癌中的预后判断临床意义。构建过表达miR-215宫颈癌HeLa细胞系，皮下注射裸鼠，监测miR-215对肿瘤生长与转移的影响。结果显示，癌组织miR-215明显高于正常组织（P<0.0001），根据miR-215表达水平分类的高危险组与低危险组五年无病生存期分别为43%和67%。此外，miR-215表达水平与临床病理分期Ⅲ期（HR：3.317；95% CI：1.18-5.14，P=0.017）、Ⅳ期（HR：3.48；95% CI：1.49-4.45，P=0.008）明显相关。注射miR-215高表达HeLa细胞的裸鼠肿瘤体积明显超过对照组。通过以上实验发现miR-215高表达可以用于肿瘤进展和不良预后的预测指标，同时说明miR-215可作为疾病复发的预测信号。（miR）10a过表达也可以确定为宫颈癌诊断的重要标志之一，Zeng T等[5]通过应用RT-PCR方法分析（miR）10a表达情况与肿瘤患者淋巴结转移之间的关系，发现miR10a模拟物明显增加宫颈癌细胞转移和浸润能力，同时也说明（miR）10a可以作为宫颈癌治疗靶点。此外，相关结果说明通过miR10a与同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）3′端非翻译区相应结合位点结合可以使PTEN翻译水平受到抑制，且miR10a模拟物可以促进β连环蛋白的核转位。同时这也说明miR10a过表达通过PTEN的靶向作用增加宫颈癌的转移。因此，miR10a可以作为宫颈癌患者的淋巴结转移的基因标志物。
3.p16INK4a
p16（INK4a）在混合体型宫颈病变组织中表达和人类乳头瘤病毒感染敏感性呈一定的相关性。通过免疫组化方法得出其蛋白的表达可以增加活组织检测的再现性和宫颈低阶段损伤的预后判断。Genovés J等[6]通过免疫组织化学方法检测86例混合体型宫颈病变患者，包括54例Ⅰ阶段上皮内肿瘤（CIN-Ⅰ）、23例 CIN-Ⅱ，和9 例CIN-Ⅲ患者的P16表达情况，此外，进行了HPV检测和基因分型，HPV负载率分别为19/54 CIN-Ⅰ、21/23 CIN-Ⅱ，和9/9 CIN-Ⅲ，p16（INK4a）在HPV阳性不同分期的患者具有免疫反应性的比例分别为7/19CIN-Ⅰ、17/21 CIN-Ⅱ、9/9 CIN-Ⅲ。p16（INK4a）在总样本中表达的比例分别为7/54 CIN-Ⅰ、17/23 CIN-Ⅱ。根据随访，在CIN-I/p16-阴性组检测到3例高级别鳞状上皮内病变，在CIN-II/p16-阴性组检测到5例高级别鳞状上皮内病变。说明P16在CIN-I、CIN-II不表达不能说明宫颈病变的恢复及CIN-Ⅱ的诊断也不应单独以P16检测结果作为依据。另外，高危险度（HPV16 和HPV18）人乳头瘤病毒感染通常是宫颈癌致病危险因子，HPV16/18-E6肿瘤蛋白是病毒持续感染和上皮转移主要因素。p16 INK4a在宫颈癌病理生理学中起到重要作用。Omran OM等通过对沙特地区患者宫颈癌组织中HPV16/18-E6和p16的表达情况，并使其与设计的临床病理预后参数（患者年龄、教育水平、避孕措施、怀孕次数、吸烟状况、组织学变异分级、临床分期、淋巴结转移）发生关联，以40例诊断及活组织检查确诊为宫颈鳞状细胞癌患者为样本。以FIGO为宫颈癌分期依据。免疫组化法分析样本中HPV16/18-E6和 p16表达情况，发现HPV16/18-E6表达情况与吸烟状态和肿瘤大小具有显著的数据相关性。HPV16/18-E6在正常组织上皮细胞和癌旁组织的表达说明HPV病毒通过血液循环至其他器官。P16表达情况与宫颈SCC分期和HPV16/18-E6表达明显相关。说明p16 和 HPV16/18-E6可以作为宫颈癌肿瘤标志物。
4.ADAM17
解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）、双调蛋白（AREG）、胞外金属蛋白诱导因子（EMMPRIN）、基质金属蛋白酶（MMPs）都是肿瘤生物学相关分子。Xu Q等通过免疫组化和western blot方法分析ADAM17、AREG、EMMPRIN、p-EGFR、p-ERK、MMP-2和 MMP-9在SiHa细胞系、HeLa 细胞系和宫颈癌组织中的表达情况并通过ELISA分析AREG活性。应用Kaplan-Meier和COX回归分析方法就ADAM17、AREG、EMMPRIN和MMP-9表达情况与宫颈癌患者生存率相关性进行分析。应用RNA干扰技术对ADAM17和 EMMPRIN进行小分子干扰。与正常组织相比ADAM17，EMMPRIN，和MMP-9在宫颈癌组织中过表达（P<0.05）。ADAM17、AREG、EMMPRIN和MMP-9高表达与癌症分期、淋巴结转移、子宫旁组织浸润、无进展生存期、总生存期显著相关（P<0.05）。多变量分析结果说明淋巴结转移、子宫旁组织浸润和ADAM17过表达可以作为宫颈癌独立预后判断指标。ADAM17RNA干扰可以减少SiHa及HeLa细胞系对EMMPRIN、p-EGFR、p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白的表达量。这些数据说明ADAM17的表达增加与癌症进展与不良预后显著相关。ADAM17可作为宫颈癌癌症进展预后判断的肿瘤标志物。 5.PHV-DNA
人乳头瘤病毒16、18、31、45L2/L1、DAPK基因甲基化可以作为宫颈癌发展过程的预后判断指标，人乳头瘤病毒基因与肿瘤细胞抑制基因能够被甲基化，为进一步研究这些生物标志物，Kalantari M等研究了104例样本，根据HPV类型、病理特征及HPV感染晚期基因及细胞DAPK基因的甲基化程度从无症状感染到发展为肿瘤分为五个临床等级，四种HPV基因型、DAPK基因在无症状感染期均为最低表达水平，并随着病程进展其表达水平不断提高，27/28肿瘤样本中同时可监测到L1/L2、DAPK基因的甲基化，但在其它病理分期样本组中也出现相对较低的甲基化片断。提示单独依靠甲基化水平很难对宫颈癌不同分期进行预测。Chen YC等通过研究CIN3+病变组织与正常宫颈组织DNA甲基化水平，发现14种基因在病变组织中甲基化水平显著差异，其中，POU4F3基因甲基化对于CIN3+病变的敏感性、特异性、精确性分别为88%、82%、85%。并通过生物信息学功能分析发现AJAP1、EDN3、EPO、MAGI2、、SOX17与β-连环蛋白信号通路相关，提示随着肿瘤疾病发展进程，这一信号通路形成后生性调节异常。说明以上基因可以作为宫颈癌病变的早期诊断的候选标志物。Buchholtz ML等研究表明四种宫颈癌细胞系中LDOC1均不表达或低表达。通过宫颈癌样本活组织检查发现LDOC1也表达下调，通过PCR技术对其启动子甲基化进行分析表明启动子甲基化与LDOC1不表达直接相关，并且可以通过DNA甲基化酶抑制剂作用恢复其表达。说明LDOC1可以作为宫颈癌诊断标志物。
6.展望
表达量异常基因研究，虽能为早期诊断提供参考，但目前仍没有敏感性与特异型十分理想的肿瘤标志物。应结合以往的研究确定出优势诊断基因，通过组织多中心试验，发现稳定的宫颈癌相关肿瘤标志物必将为提高宫颈癌治愈率提供保障。
参考文献：
[1]Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global Cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.
[2]Ndiaye R，Dem A，Mbaye PM，et al.Study of codon 72 of p53 gene as a risk-factor in cervical cancer in Senegal[J].Bull Cancer，2014，[Epub ahead of print].
[3]Hellberg D，Tot T.Tumor marker score for prognostication of early-stage squamous cell cervical cancer[J].Anticancer Res.2014，34（2）：887-92.
[4]Liang H，Li Y，Luo RY，et al.MicroRNA-215 is a potential prognostic marker for cervical cancer[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2014，34（2）：207-12.
[5]Zeng T，Li G.MicroRNA10a enhances the metastatic potential of cervical cancer cells by targeting phosphatase and tensin homologue[J].Mol Med Rep. 2014，[Epub ahead of print].
[6]Genovés J，Alameda F，Mancebo G，et al.Human papillomavirus detection and p16INK4a expression in cervical lesions：a comparative study[J].Hum Pathol. 2014，45（4）：826-33.
1.P53基因
除人乳头瘤病毒感染，遗传因素也是促使宫颈癌易患的一个重要因素，人类不同种群中P53基因72位密码子的精氨酸等位基因已经被报道是一个宫颈癌致患的危险因子。Ndiaye R等[2]研究了这一危险因子在塞内加尔人群中的多态性。通过个案对照试验，以30例宫颈癌患者为病例组，以93例未被诊断为宫颈癌女性为对照组，提取全血DNA，应用PCR-RFLP方法分析72位密码子的多态性，发现精氨酸等位基因与宫颈癌易感性的相关性不高（P=0.354）。此外，通过分析形态学损伤与精氨酸等位基因的相互关系，也发现精氨酸等位基因与宫颈癌易患敏感性之间关系也不紧密，研究表明P53作为基因标志物遗传因素是其重要影响因素之一。Hellberg D等[3]以128例浸入型宫颈癌组织为样本，随访10年以上，通过免疫组化法监测12种基因的表达情况，结合病理学特征与预后，确定LRIG1、LRIG2、p53、COX2 和 c-MYC这5个基因与预后分数高度相关，0-5分范围，0-1分10年死亡率低于5%，而4-5分达到70%。使用不同模型，可用于高敏感性和高特异性阳性、阴性预测。建立肿瘤标志物分数模型可以对临床病理学和临床参数进行早期预测，为调整治疗方案提供依据。
2.MicroRNA
MicroRNAs与很多影响肿瘤发展和转移的生物学通路相关，且可以作为多种肿瘤预后判断的标志物。Liang H等[4]以诊断为宫颈癌Ⅱ期302位患者的宫颈癌组织为样本，应用qRT-PCR技术监测miR215的表达情况，Cox回归分析确定miR-215表达临界值，从而研究miR215在宫颈癌中的预后判断临床意义。构建过表达miR-215宫颈癌HeLa细胞系，皮下注射裸鼠，监测miR-215对肿瘤生长与转移的影响。结果显示，癌组织miR-215明显高于正常组织（P<0.0001），根据miR-215表达水平分类的高危险组与低危险组五年无病生存期分别为43%和67%。此外，miR-215表达水平与临床病理分期Ⅲ期（HR：3.317；95% CI：1.18-5.14，P=0.017）、Ⅳ期（HR：3.48；95% CI：1.49-4.45，P=0.008）明显相关。注射miR-215高表达HeLa细胞的裸鼠肿瘤体积明显超过对照组。通过以上实验发现miR-215高表达可以用于肿瘤进展和不良预后的预测指标，同时说明miR-215可作为疾病复发的预测信号。（miR）10a过表达也可以确定为宫颈癌诊断的重要标志之一，Zeng T等[5]通过应用RT-PCR方法分析（miR）10a表达情况与肿瘤患者淋巴结转移之间的关系，发现miR10a模拟物明显增加宫颈癌细胞转移和浸润能力，同时也说明（miR）10a可以作为宫颈癌治疗靶点。此外，相关结果说明通过miR10a与同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）3′端非翻译区相应结合位点结合可以使PTEN翻译水平受到抑制，且miR10a模拟物可以促进β连环蛋白的核转位。同时这也说明miR10a过表达通过PTEN的靶向作用增加宫颈癌的转移。因此，miR10a可以作为宫颈癌患者的淋巴结转移的基因标志物。
3.p16INK4a
p16（INK4a）在混合体型宫颈病变组织中表达和人类乳头瘤病毒感染敏感性呈一定的相关性。通过免疫组化方法得出其蛋白的表达可以增加活组织检测的再现性和宫颈低阶段损伤的预后判断。Genovés J等[6]通过免疫组织化学方法检测86例混合体型宫颈病变患者，包括54例Ⅰ阶段上皮内肿瘤（CIN-Ⅰ）、23例 CIN-Ⅱ，和9 例CIN-Ⅲ患者的P16表达情况，此外，进行了HPV检测和基因分型，HPV负载率分别为19/54 CIN-Ⅰ、21/23 CIN-Ⅱ，和9/9 CIN-Ⅲ，p16（INK4a）在HPV阳性不同分期的患者具有免疫反应性的比例分别为7/19CIN-Ⅰ、17/21 CIN-Ⅱ、9/9 CIN-Ⅲ。p16（INK4a）在总样本中表达的比例分别为7/54 CIN-Ⅰ、17/23 CIN-Ⅱ。根据随访，在CIN-I/p16-阴性组检测到3例高级别鳞状上皮内病变，在CIN-II/p16-阴性组检测到5例高级别鳞状上皮内病变。说明P16在CIN-I、CIN-II不表达不能说明宫颈病变的恢复及CIN-Ⅱ的诊断也不应单独以P16检测结果作为依据。另外，高危险度（HPV16 和HPV18）人乳头瘤病毒感染通常是宫颈癌致病危险因子，HPV16/18-E6肿瘤蛋白是病毒持续感染和上皮转移主要因素。p16 INK4a在宫颈癌病理生理学中起到重要作用。Omran OM等通过对沙特地区患者宫颈癌组织中HPV16/18-E6和p16的表达情况，并使其与设计的临床病理预后参数（患者年龄、教育水平、避孕措施、怀孕次数、吸烟状况、组织学变异分级、临床分期、淋巴结转移）发生关联，以40例诊断及活组织检查确诊为宫颈鳞状细胞癌患者为样本。以FIGO为宫颈癌分期依据。免疫组化法分析样本中HPV16/18-E6和 p16表达情况，发现HPV16/18-E6表达情况与吸烟状态和肿瘤大小具有显著的数据相关性。HPV16/18-E6在正常组织上皮细胞和癌旁组织的表达说明HPV病毒通过血液循环至其他器官。P16表达情况与宫颈SCC分期和HPV16/18-E6表达明显相关。说明p16 和 HPV16/18-E6可以作为宫颈癌肿瘤标志物。
4.ADAM17
解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）、双调蛋白（AREG）、胞外金属蛋白诱导因子（EMMPRIN）、基质金属蛋白酶（MMPs）都是肿瘤生物学相关分子。Xu Q等通过免疫组化和western blot方法分析ADAM17、AREG、EMMPRIN、p-EGFR、p-ERK、MMP-2和 MMP-9在SiHa细胞系、HeLa 细胞系和宫颈癌组织中的表达情况并通过ELISA分析AREG活性。应用Kaplan-Meier和COX回归分析方法就ADAM17、AREG、EMMPRIN和MMP-9表达情况与宫颈癌患者生存率相关性进行分析。应用RNA干扰技术对ADAM17和 EMMPRIN进行小分子干扰。与正常组织相比ADAM17，EMMPRIN，和MMP-9在宫颈癌组织中过表达（P<0.05）。ADAM17、AREG、EMMPRIN和MMP-9高表达与癌症分期、淋巴结转移、子宫旁组织浸润、无进展生存期、总生存期显著相关（P<0.05）。多变量分析结果说明淋巴结转移、子宫旁组织浸润和ADAM17过表达可以作为宫颈癌独立预后判断指标。ADAM17RNA干扰可以减少SiHa及HeLa细胞系对EMMPRIN、p-EGFR、p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白的表达量。这些数据说明ADAM17的表达增加与癌症进展与不良预后显著相关。ADAM17可作为宫颈癌癌症进展预后判断的肿瘤标志物。 5.PHV-DNA
人乳头瘤病毒16、18、31、45L2/L1、DAPK基因甲基化可以作为宫颈癌发展过程的预后判断指标，人乳头瘤病毒基因与肿瘤细胞抑制基因能够被甲基化，为进一步研究这些生物标志物，Kalantari M等研究了104例样本，根据HPV类型、病理特征及HPV感染晚期基因及细胞DAPK基因的甲基化程度从无症状感染到发展为肿瘤分为五个临床等级，四种HPV基因型、DAPK基因在无症状感染期均为最低表达水平，并随着病程进展其表达水平不断提高，27/28肿瘤样本中同时可监测到L1/L2、DAPK基因的甲基化，但在其它病理分期样本组中也出现相对较低的甲基化片断。提示单独依靠甲基化水平很难对宫颈癌不同分期进行预测。Chen YC等通过研究CIN3+病变组织与正常宫颈组织DNA甲基化水平，发现14种基因在病变组织中甲基化水平显著差异，其中，POU4F3基因甲基化对于CIN3+病变的敏感性、特异性、精确性分别为88%、82%、85%。并通过生物信息学功能分析发现AJAP1、EDN3、EPO、MAGI2、、SOX17与β-连环蛋白信号通路相关，提示随着肿瘤疾病发展进程，这一信号通路形成后生性调节异常。说明以上基因可以作为宫颈癌病变的早期诊断的候选标志物。Buchholtz ML等研究表明四种宫颈癌细胞系中LDOC1均不表达或低表达。通过宫颈癌样本活组织检查发现LDOC1也表达下调，通过PCR技术对其启动子甲基化进行分析表明启动子甲基化与LDOC1不表达直接相关，并且可以通过DNA甲基化酶抑制剂作用恢复其表达。说明LDOC1可以作为宫颈癌诊断标志物。
6.展望
表达量异常基因研究，虽能为早期诊断提供参考，但目前仍没有敏感性与特异型十分理想的肿瘤标志物。应结合以往的研究确定出优势诊断基因，通过组织多中心试验，发现稳定的宫颈癌相关肿瘤标志物必将为提高宫颈癌治愈率提供保障。
参考文献：
[1]Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global Cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.
[2]Ndiaye R，Dem A，Mbaye PM，et al.Study of codon 72 of p53 gene as a risk-factor in cervical cancer in Senegal[J].Bull Cancer，2014，[Epub ahead of print].
[3]Hellberg D，Tot T.Tumor marker score for prognostication of early-stage squamous cell cervical cancer[J].Anticancer Res.2014，34（2）：887-92.
[4]Liang H，Li Y，Luo RY，et al.MicroRNA-215 is a potential prognostic marker for cervical cancer[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2014，34（2）：207-12.
[5]Zeng T，Li G.MicroRNA10a enhances the metastatic potential of cervical cancer cells by targeting phosphatase and tensin homologue[J].Mol Med Rep. 2014，[Epub ahead of print].
[6]Genovés J，Alameda F，Mancebo G，et al.Human papillomavirus detection and p16INK4a expression in cervical lesions：a comparative study[J].Hum Pathol. 2014，45（4）：826-33.