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摘要[目的]研究蟹类DNA条形码技术。[方法]利用PCR技术对浙江沿海6种常见蟹类（n=34）mtDNA COI基因进行扩增，最终获得688 bp基因片段。[结果]7个红星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）样品中检测出5个单倍型，5个锐齿蟳（Charybdis acuta）样品中检测出5个单倍型，锈斑蟳（C.feriatus）、日本蟳（C.japonica）、绵蟹（Dromia dehaani）、三疣梭子蟹（P.trituberculatus）样品中检测出单倍型数分别为3、2、2、1；6种蟹类COI基因T、C、A、G的平均含量分别为25.3%、18.2%、36.2%和20.3%，A+T含量为58.5%～64.1%；种内变异较小，遗传距离处于0.000～0.004，种间遗传距离为0.143～0.235；使用最大似然法构建的分子进化树揭示相同物种个体首先聚类，不存在不同物种个体交叉聚类。[结论]COI-L1490/H2198通用引物在蟹类条形码研究中具有普遍适用性，mtDNA COI基因能夠作为6种蟹类有效鉴别的DNA条形码，且区分度高、支持形态学分类结果。
关键词蟹类；DNA条形码；COI基因
中图分类号S188+.1；Q75文献标识码A文章编号0517-6611（2017）26-0131-02
Identification Technology Research on DNA Barcode of Six Crabs Species
WANG Naling， HU Zehui， BIAN Guangming，CHAI Xuejun* et al
（Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University， Zhejiang Marine Fisheries Institute， Zhoushan，Zhejiang 316021）
Abstract[Odjective] To study DNA barcode of crab. [Method] PCR technique was used to amplify the mtDNA COI gene in six crabs species collected from Zhejiang coastal sea， obtaining 688 bp gene fragment. [Result] Seven individuals of Portunus sanguinolentus were tested for five haplotypes， five haplotypes were detected in five C.acuta samples， and the haplotypes of C. feriatus， C .japonica， D.dehaani， P. trituberculatus were 3， 2， 2 and 1.The average content of 6 species of COI gene T， C， A and G of crabs was 25.3%， 18.2%， 36.2% and 20.3%，A + T was 58.5%-64.1%. The variation of the species was just a little， the genetic distance was 0.000-0.004， the range of genetic distance was 0.149-0.241. Phylogenetic tree using maximum likelihood method revealed that the same species of species firstly cluster， and there was no individual crossclustering of individual species. [Conclusion] The analysis indicated that the primer pair of COI-L1490/H2198 for crabs had universal applicability in the barcode study. mtDNA COI gene could be used as a DNA barcode of 6 crabs， with higher distinguish degree supporting the morphological classification.
Key wordsCrabs；DNA barcode；COI gene
浙江海域蟹类资源十分丰富，自20世纪70年代后期以来，捕捞强度剧增，致使浙江沿海传统的底层鱼类资源衰退，捕食虾蟹类的鱼类减少，使虾蟹类生存空间扩大，资源发生量增多，数量增长较快[1]。快速、精准鉴定各种蟹类，对于物种保护、蟹类资源高效利用具有重要意义。然而，海洋生物形态鉴定方法具有较大局限性，易受物种性别和发育阶段的限制，物种表型可塑性以及遗传多样性都会使其无法精准识别物种[2]。
DNA 条形码（DNA barcode）是一段能够快速、准确鉴别物种的标准DNA 序列[3]。DNA条形码技术对样品要求低、克服表型类似影响、检测自动化、管理数据化、鉴别规模化，与传统的分类方法相互佐证，能够实现物种的高效、精准鉴定。Raupach等[4]研究分析北海甲壳类动物高效识别系统，发现DNA条形码技术在北海甲壳类动物的识别中具有高效性。Radulovici等[5]对圣劳伦斯河河口和海湾的 460 种海洋甲壳类（n=507）进行COI分析，结果显示种间差异比种内差异高25倍，95%的个体序列差异和形态相一致，证实了DNA条形码技术在海洋甲壳类物种鉴定中的有效性。目前，蟹类mtDNA COI基因条形码研究主要见于青蟹属（Scylla spp）[6-7]、华溪蟹属（Sinopotamon spp）[8-9]、蟳属（Charybdis spp）[10]。 该研究通过PCR技术对浙江沿海6种常见蟹类（n=34）mtDNA COI 基因進行扩增，获得相应DNA条形码，以期为海洋生态学、海洋分类学和海洋生物分子系统学研究提供基础数据与资料，为浙江沿海蟹类种质资源的保护与合理开发利用以及海关检测等领域提供科学的理论依据和技术参考。
1材料与方法
1.1材料
该试验所用蟹类取自浙江沿海，置于实验室超低温冰箱 （-20 ℃）保存备用，具体采集信息见表1。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取。
采用天根海洋动物基因组提取试剂盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作说明提取样品总基因组DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测DNA质量与浓度，并稀释为50 ng/μL，置于-20 ℃保存。
1.2.2PCR扩增及测序。
PCR采用通用引物COI-L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG -3′和COI-H2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′（上海生工合成），反应体系为25 μL，包含2×Taq MasterMix（康维世纪）12.5 μL，模板DNA 100 ng，10 μmol/L的引物各1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测验证条带的大小后，送往上海杰李生物技术有限公司测序。
1.3数据分析
采用BioEdit[11]对所得序列进行编辑，用MEGA 5.0软件[12]分析序列碱基组成，并使用 Kimura 2-parameter模型计算各蟹类遗传距离，利用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建分子发育进化树，并采用Bootstrap 1000检验系统树各分支的置信度。
2结果与分析
2.1PCR琼脂糖凝胶电泳结果
PCR扩增产物凝胶电泳结果见图1。产物片段大小与设计的目的片段长度相符（688 bp），条带明亮、清晰、无杂带，满足测序要求。
2.2序列分析
采用BioEdit对测序所得序列进行编
辑，去除序列两端不稳定部分，并通过Blast分析比较，确认得到688 bp的COI基因片段。7个P.sanguinolentus样品中检测出5个单倍型（Ps1～5），5个C.acuta样品检测到5个单倍型（Ca1～5），4个C.feriatus样品中检测到3个单倍型（Cf1～3）、C.japonica、D.dehaani、P.trituberculatus检测出单倍型（Cj1～2、Dd1～2、Pt）数依次为2、2、1。
通过MEGA 5.0软件计算6种蟹类COI序列的碱基组成（表2），T、C、A、G的平均含量分别为25.3%、18.2%、362%和20.3%，A+T的平均含量为61.5%。6种蟹类COI基因A+T含量为58.9%～64.1%，明显高于G+C含量，与甲壳类等无脊椎动物COI基因片段结构相似，具有后生动物线粒体基因AT偏倚性[13-14]。
2.3遗传距离
对所获6种蟹类COI序列进行遗传距离分析，由表3可知，6种蟹类种内变异较小，遗传距离处于0.000～0.004，平均值为0.003；种间遗传距离为0.143～0.235，平均值为0.192，其中P.sanguinolentus与C.acuta种间遗传距离最高（0.235），C.japonica与C.feriatus遗传距离最低（0.143）。
2.4系统进化关系
利用最大似然法构建6种蟹类分子进化树（图2），支上数值为1 000次重复抽样检验置信度，如拓扑图所示，同一物种首先聚类，分子树分为3个类群，C.japonica、C.feriatus和C.acuta首先聚为1支，P.sanguinolentus、P.trituberculatus聚为1支，D.dehaani独立为1支。
3讨论
Hebert等[15]提出，种内遗传距离很少大于2%，大部分种内遗传距离小于1%，种间遗传距离大于种内遗传距离是利用COI序列有效鉴别物种关键。该研究中6种蟹类种内遗传距离处于0.000～0.004，平均值为0.003；种间遗传距离为0.143～0.235，平均值为0.192，种间平均遗传距离是种内的64倍，满足Hebert等[15]推荐的10倍种内变异作为标记物种遗传分化的标准序列阈值；ML系统进化树显示：相同物种个体首先聚类，不存在不同物种个体交叉聚类，鉴别区分度高，支持形态学分类结果。由此表明，以mtDNA COI基因作为6个蟹类品种鉴定的DNA条形码具有可行性和有效性。此外，基于线粒体COI基因P.sanguinolentus、C.acuta的单倍型较高，适用于群体遗传多样性研究。
该研究通过mtDNA COI基因通用型引物COI-L1490/H2198成功对6种浙江沿海常见蟹类进行PCR扩增，表明COI-L1490/H2198型引物在蟹类条形码研究中具有普遍适用性。研究结果为浙江沿海蟹类鉴别研究提供一定基础资料，但仅依靠单个或少数几个基因数据的比对，尚不足以准确判断相关海域物种的群体遗传多样性。遗传距离分析结果表明，P.trituberculatus与P.sanguinolentus同属于Portunus spp.，但其遗传距离（0.196）高于P.trituberculatus与C.feriatus的遗传距离（0.176）。故而，在研究相关蟹类群体遗传多 样性时，应获取更多的序列片段以完善相关蟹类基因组数据。
参考文献
[1] 薛利建，卢占晖，周永东，等.浙江桁杆拖虾网渔业现状分析[J].渔业信息与战略，2011，26（5）：6-8.
[2] 李琪，邹山梅，郑小东，等.DNA条形码及其在海洋生物中的应用[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2010，40（8）：43-47.
[3] 钱路，安榆林.物种鉴定的新武器：基因条码[J].植物检疫，2009，23（3）：42-46.
[4] RAUPACH M J，KNEBELSBERGER T，LAAKMANN S，et al.DNA barcoding of amphipoda from the North Sea[C]//New frontiers in Monitoring European Biodiversity Conference.Palermo，Italy：[s.n.]，2011.
[5] RADULOVICI A E，SAINTEMARIE B，DUFRESEN F.DNA barcoding of marine crustaceans from the Estuary and Gulf of St Lawrence：A regionalscale approach[J].Molecular ecology resources，2009，9（S1）：181-187.
[6] 马凌波，张凤英，乔振国，等.中國东南沿海青蟹线粒体COI基因部分序列分析[J].水产学报，2006，30（4）：463-468.
[7] 林琪，李少菁，黎中宝，等.中国东南沿海青蟹属不同种类的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育[J].厦门大学学报（自然科学版），2008，47（2）：268-273.
[8] 白俊，聂宗恒，朱春潮，等.秦岭山脉华溪蟹属（Sinopotamon）淡水蟹DNA条形码[J].南昌大学学报（理科版），2016，40（4）：372-380.
[9] 徐武杰，邹节新，白俊，等.鄱阳湖流域华溪蟹属 DNA 条形码[J].南昌大学学报（理科版），2015（4）：402-408.
[10] 杨柯，马春艳，马凌波.基于COI基因序列变异探讨日本蟳遗传多样性[J].安徽农业科学，2009，37（25）：11895-11896.
[11] HALL T A.BioEdit：A userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium series，1999，41：95-98.
[12] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular biology evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[13] 胡婧，刘念，黄原.节肢动物线粒体基因组研究进展与基因顺序分析[J].昆虫分类学报，2006，28（2）：153-160.
[14] 郭天慧，孔晓瑜，陈四清，等.三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2004，34（1）：22-28.
[15] HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al.Biological identification through DNA barcodes[J].Proceedings of the royal society B biological sciences，2003，270（1512）：313-321.
关键词蟹类；DNA条形码；COI基因
中图分类号S188+.1；Q75文献标识码A文章编号0517-6611（2017）26-0131-02
Identification Technology Research on DNA Barcode of Six Crabs Species
WANG Naling， HU Zehui， BIAN Guangming，CHAI Xuejun* et al
（Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University， Zhejiang Marine Fisheries Institute， Zhoushan，Zhejiang 316021）
Abstract[Odjective] To study DNA barcode of crab. [Method] PCR technique was used to amplify the mtDNA COI gene in six crabs species collected from Zhejiang coastal sea， obtaining 688 bp gene fragment. [Result] Seven individuals of Portunus sanguinolentus were tested for five haplotypes， five haplotypes were detected in five C.acuta samples， and the haplotypes of C. feriatus， C .japonica， D.dehaani， P. trituberculatus were 3， 2， 2 and 1.The average content of 6 species of COI gene T， C， A and G of crabs was 25.3%， 18.2%， 36.2% and 20.3%，A + T was 58.5%-64.1%. The variation of the species was just a little， the genetic distance was 0.000-0.004， the range of genetic distance was 0.149-0.241. Phylogenetic tree using maximum likelihood method revealed that the same species of species firstly cluster， and there was no individual crossclustering of individual species. [Conclusion] The analysis indicated that the primer pair of COI-L1490/H2198 for crabs had universal applicability in the barcode study. mtDNA COI gene could be used as a DNA barcode of 6 crabs， with higher distinguish degree supporting the morphological classification.
Key wordsCrabs；DNA barcode；COI gene
浙江海域蟹类资源十分丰富，自20世纪70年代后期以来，捕捞强度剧增，致使浙江沿海传统的底层鱼类资源衰退，捕食虾蟹类的鱼类减少，使虾蟹类生存空间扩大，资源发生量增多，数量增长较快[1]。快速、精准鉴定各种蟹类，对于物种保护、蟹类资源高效利用具有重要意义。然而，海洋生物形态鉴定方法具有较大局限性，易受物种性别和发育阶段的限制，物种表型可塑性以及遗传多样性都会使其无法精准识别物种[2]。
DNA 条形码（DNA barcode）是一段能够快速、准确鉴别物种的标准DNA 序列[3]。DNA条形码技术对样品要求低、克服表型类似影响、检测自动化、管理数据化、鉴别规模化，与传统的分类方法相互佐证，能够实现物种的高效、精准鉴定。Raupach等[4]研究分析北海甲壳类动物高效识别系统，发现DNA条形码技术在北海甲壳类动物的识别中具有高效性。Radulovici等[5]对圣劳伦斯河河口和海湾的 460 种海洋甲壳类（n=507）进行COI分析，结果显示种间差异比种内差异高25倍，95%的个体序列差异和形态相一致，证实了DNA条形码技术在海洋甲壳类物种鉴定中的有效性。目前，蟹类mtDNA COI基因条形码研究主要见于青蟹属（Scylla spp）[6-7]、华溪蟹属（Sinopotamon spp）[8-9]、蟳属（Charybdis spp）[10]。 该研究通过PCR技术对浙江沿海6种常见蟹类（n=34）mtDNA COI 基因進行扩增，获得相应DNA条形码，以期为海洋生态学、海洋分类学和海洋生物分子系统学研究提供基础数据与资料，为浙江沿海蟹类种质资源的保护与合理开发利用以及海关检测等领域提供科学的理论依据和技术参考。
1材料与方法
1.1材料
该试验所用蟹类取自浙江沿海，置于实验室超低温冰箱 （-20 ℃）保存备用，具体采集信息见表1。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取。
采用天根海洋动物基因组提取试剂盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作说明提取样品总基因组DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测DNA质量与浓度，并稀释为50 ng/μL，置于-20 ℃保存。
1.2.2PCR扩增及测序。
PCR采用通用引物COI-L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG -3′和COI-H2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′（上海生工合成），反应体系为25 μL，包含2×Taq MasterMix（康维世纪）12.5 μL，模板DNA 100 ng，10 μmol/L的引物各1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测验证条带的大小后，送往上海杰李生物技术有限公司测序。
1.3数据分析
采用BioEdit[11]对所得序列进行编辑，用MEGA 5.0软件[12]分析序列碱基组成，并使用 Kimura 2-parameter模型计算各蟹类遗传距离，利用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建分子发育进化树，并采用Bootstrap 1000检验系统树各分支的置信度。
2结果与分析
2.1PCR琼脂糖凝胶电泳结果
PCR扩增产物凝胶电泳结果见图1。产物片段大小与设计的目的片段长度相符（688 bp），条带明亮、清晰、无杂带，满足测序要求。
2.2序列分析
采用BioEdit对测序所得序列进行编
辑，去除序列两端不稳定部分，并通过Blast分析比较，确认得到688 bp的COI基因片段。7个P.sanguinolentus样品中检测出5个单倍型（Ps1～5），5个C.acuta样品检测到5个单倍型（Ca1～5），4个C.feriatus样品中检测到3个单倍型（Cf1～3）、C.japonica、D.dehaani、P.trituberculatus检测出单倍型（Cj1～2、Dd1～2、Pt）数依次为2、2、1。
通过MEGA 5.0软件计算6种蟹类COI序列的碱基组成（表2），T、C、A、G的平均含量分别为25.3%、18.2%、362%和20.3%，A+T的平均含量为61.5%。6种蟹类COI基因A+T含量为58.9%～64.1%，明显高于G+C含量，与甲壳类等无脊椎动物COI基因片段结构相似，具有后生动物线粒体基因AT偏倚性[13-14]。
2.3遗传距离
对所获6种蟹类COI序列进行遗传距离分析，由表3可知，6种蟹类种内变异较小，遗传距离处于0.000～0.004，平均值为0.003；种间遗传距离为0.143～0.235，平均值为0.192，其中P.sanguinolentus与C.acuta种间遗传距离最高（0.235），C.japonica与C.feriatus遗传距离最低（0.143）。
2.4系统进化关系
利用最大似然法构建6种蟹类分子进化树（图2），支上数值为1 000次重复抽样检验置信度，如拓扑图所示，同一物种首先聚类，分子树分为3个类群，C.japonica、C.feriatus和C.acuta首先聚为1支，P.sanguinolentus、P.trituberculatus聚为1支，D.dehaani独立为1支。
3讨论
Hebert等[15]提出，种内遗传距离很少大于2%，大部分种内遗传距离小于1%，种间遗传距离大于种内遗传距离是利用COI序列有效鉴别物种关键。该研究中6种蟹类种内遗传距离处于0.000～0.004，平均值为0.003；种间遗传距离为0.143～0.235，平均值为0.192，种间平均遗传距离是种内的64倍，满足Hebert等[15]推荐的10倍种内变异作为标记物种遗传分化的标准序列阈值；ML系统进化树显示：相同物种个体首先聚类，不存在不同物种个体交叉聚类，鉴别区分度高，支持形态学分类结果。由此表明，以mtDNA COI基因作为6个蟹类品种鉴定的DNA条形码具有可行性和有效性。此外，基于线粒体COI基因P.sanguinolentus、C.acuta的单倍型较高，适用于群体遗传多样性研究。
该研究通过mtDNA COI基因通用型引物COI-L1490/H2198成功对6种浙江沿海常见蟹类进行PCR扩增，表明COI-L1490/H2198型引物在蟹类条形码研究中具有普遍适用性。研究结果为浙江沿海蟹类鉴别研究提供一定基础资料，但仅依靠单个或少数几个基因数据的比对，尚不足以准确判断相关海域物种的群体遗传多样性。遗传距离分析结果表明，P.trituberculatus与P.sanguinolentus同属于Portunus spp.，但其遗传距离（0.196）高于P.trituberculatus与C.feriatus的遗传距离（0.176）。故而，在研究相关蟹类群体遗传多 样性时，应获取更多的序列片段以完善相关蟹类基因组数据。
参考文献
[1] 薛利建，卢占晖，周永东，等.浙江桁杆拖虾网渔业现状分析[J].渔业信息与战略，2011，26（5）：6-8.
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[3] 钱路，安榆林.物种鉴定的新武器：基因条码[J].植物检疫，2009，23（3）：42-46.
[4] RAUPACH M J，KNEBELSBERGER T，LAAKMANN S，et al.DNA barcoding of amphipoda from the North Sea[C]//New frontiers in Monitoring European Biodiversity Conference.Palermo，Italy：[s.n.]，2011.
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[6] 马凌波，张凤英，乔振国，等.中國东南沿海青蟹线粒体COI基因部分序列分析[J].水产学报，2006，30（4）：463-468.
[7] 林琪，李少菁，黎中宝，等.中国东南沿海青蟹属不同种类的mtDNA COI基因序列分析及其系统发育[J].厦门大学学报（自然科学版），2008，47（2）：268-273.
[8] 白俊，聂宗恒，朱春潮，等.秦岭山脉华溪蟹属（Sinopotamon）淡水蟹DNA条形码[J].南昌大学学报（理科版），2016，40（4）：372-380.
[9] 徐武杰，邹节新，白俊，等.鄱阳湖流域华溪蟹属 DNA 条形码[J].南昌大学学报（理科版），2015（4）：402-408.
[10] 杨柯，马春艳，马凌波.基于COI基因序列变异探讨日本蟳遗传多样性[J].安徽农业科学，2009，37（25）：11895-11896.
[11] HALL T A.BioEdit：A userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium series，1999，41：95-98.
[12] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular biology evolution，2011，28（10）：2731-2739.
[13] 胡婧，刘念，黄原.节肢动物线粒体基因组研究进展与基因顺序分析[J].昆虫分类学报，2006，28（2）：153-160.
[14] 郭天慧，孔晓瑜，陈四清，等.三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2004，34（1）：22-28.
[15] HEBERT P D N，CYWINSKA A，BALL S L，et al.Biological identification through DNA barcodes[J].Proceedings of the royal society B biological sciences，2003，270（1512）：313-321.