【摘 要】
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目的 通过原核表达系统表达可溶性塔城病毒1 (Tacheng tick virus 1,TcTV-1)重组融合核蛋白(nucleoprotein,NP)并纯化获得纯度高和均一度好的目的蛋白.方法 利用聚合酶链式反
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目的 通过原核表达系统表达可溶性塔城病毒1 (Tacheng tick virus 1,TcTV-1)重组融合核蛋白(nucleoprotein,NP)并纯化获得纯度高和均一度好的目的蛋白.方法 利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从经密码子优化的重组质粒中扩增TcTV-1核蛋白的编码基因,构建带有小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)融合标签的重组质粒pET-21a-TcTV-1-NP,转化入表达菌株BL21 (DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-t hiogalactopyranoside,IPTG)诱导高表达量菌株.采用镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析提纯目的蛋白.结果 经PCR扩增的目的基因TcTV-1核蛋白和质粒载体pET-21a进行重组质粒构建,电泳结果显示,在约6 000 bp处可见条带,与重组质粒pET-21a-TcTV-1-NP大小相一致;重组质粒转人大肠埃希菌BL21 (DE3),在16℃,0.2 mmol/L IPTG诱导下表达出大量可溶性蛋白,收集并重悬菌体后,经低温高压和超声破碎后,细菌上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,在250 mmol/L咪唑洗脱液中获得目的蛋白;去除融合标签后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示在相对分子质量为50 000附近处出现明显条带,与目的蛋白相对分子质量为48 800相一致;目的蛋白通过阳离子交换层析,得到1个蛋白洗脱峰;经凝胶过滤层析再次纯化,收集相应的蛋白洗脱峰,经SDS-PAGE结果显示目的蛋白大小正确,纯度较高.结论 TcTV-1重组融合核蛋白在大肠埃希菌内以可溶性形式成功表达,为进一步研究TcTV-1核蛋白的作用机制和相应血清学检测方法的开发提供了重要的基础.
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