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摘 要 通过本地查找胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）橡胶菌株全基因组测序数据，获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因，获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现，该片段含有完整的开放式阅读框，与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列，序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp，其中含有1个大小为59 bp的内含子，推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域，推测该基因参与环境pH感应信号转导途径（Ambient pH-sensing signal transduetion pathway）的调控，为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。
关键词 芒果；胶孢炭疽菌；pH信号转导途径
中图分类号 Q78 文献标识码 A
Cloning and Characterization of Ambient pH Signal
Regulatory Gene from Mango Anthracnose
JIA Jing1，2， PU Jinji1， ZHANG He1， QI Yanxiang1， XIE Yixian1 *
1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultutal Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
2 Environment and Plant Protection College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Based on the complete genome sequence of Colletotrichum gloeosporioides from Rubber and using the traditional homogene cloning method， PalF gene was cloned from C. gloeosporioides of Mango， and the objective gene fragment with the size of 2 369 bp were acquired. The gene sequence analysis showed that it included an intact open reading frame， and had 100% sequence homology with PalF gene of C. gloeosporioides from Rubber. The cDNA sequence of PalF gene obtained by RT-PCR had a length of 2 310 bp encoding a protein of 769 amino acid residues with one 59 bp intron. The analysis of conserved regions of amino acid sequence of PalF gene indicated that PalF protein contains a conservative domain of Arrestin-C， and presumed that PalF gene participated in the regulation of ambient pH-sensing signal transduction pathway which lays the foundation for further study of the gene on the role of ambient pH-sensing signal transduction pathway.
Key words Mango； Colletotrichum gloeosporioides； Ambient pH-sensing signal transduction pathway
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.023
芒果炭疽病（Mango anthracnose），是目前影响芒果产量和品质最重要的病害之一。引起芒果炭疽病的主要病原菌为刺盘孢属胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides Penz（Penz.）Sacc.]。常造成叶斑、枝条回枯、落花落果，由于其潜伏侵染的特性，在采后贮藏过程中易造成果实腐烂[1]。在病原真菌与寄主互作过程中，寄主组织对环境pH信号具有调控作用，而病原真菌则通过环境pH感应信号转导途径（Ambient pH-sensing signal transduetion pathway）以对不同寄主的pH环境信号作出响应[2-3]。丝状真菌中环境pH感应信号转导途径由pacC、palA、palB、palC、palF、palH和palI 7个基因介导[3]，其中，环境pH信号转导途径通过对转录因子pacC的介导实现相关基因的表达调控；palB有可能是信号依赖性蛋白水解酶，在环境pH信号转导途径中起到催化作用；palA参与palB对pacC的水解；palH和palI分别有7个和4个推测的跨膜结构域，推测起着感受环境pH的作用；palI在环境pH信号转导途径中起到的作用目前还不清楚[3]。PalF蛋白帮助协助palH蛋白在膜上的定位[4]，PalF基因编码蛋白是一种阻遏蛋白（Arrestin），在碱性条件下负责激活转录激活因子pacC，这种对碱性pH的应答是由保守的信号途径RIM101途径控制[5-6]。然而，目前在芒果胶孢炭疽菌系统中尚未开展关于palF基因有关的研究，为了明确palF基因在pH感应信号转导途径中的作用，本研究克隆了胶孢炭疽菌环境pH信号调控基因palF，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 1 材料与方法
1.1 供试菌种和试剂
试验所需的芒果胶孢炭疽菌A2由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供。Recombinant Taq polymerase、pMD18-T Vector、E.coli Competent Cells DH5α、Prime Script High Fidelity RT-PCR Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司；Fungal RNA Kit购自OMEGA公司。引物的合成和测序均委托英骏生物技术有限公司[Invitrogen Biotechnology（Shanghai）Co.，Ltd.]完成。
1.2 实验方法
2 结果与分析
2.1 芒果胶孢炭疽菌PalF基因的PCR扩增及克隆
根据胶胞炭疽菌（橡胶菌株）PalF基因设计引物同源扩增胶孢炭疽菌（芒果菌株）基因组DNA，得到1条预期的2 000多碱基的条带，进行切胶回收与克隆转化，测序结果表明片段大小为2 369 bp（图1）。用DNAman5.2软件与胶孢炭疽菌（橡胶菌株）PalF基因序列进行比对，分析结果表明，两者碱基序列同源性达100%。该基因序列已经提交至GenBank，序列登记号为KF479350。用芒果胶孢炭疽菌PalF基因PCR扩增的特异性引物来扩增PalF基因的表达序列，得到1条约2 300碱基的条带，进行切胶回收和克隆转化，测序结果表明大小为2 310 bp（图2）。
2.2 芒果胶孢炭疽菌PalF基因的序列分析
2.2.1 PalF基因的全长DNA和cDNA序列分析
用DNAman软件比对分析PalF基因的DNA和cDNA序列，发现PalF基因中含有1个大小为59 bp的内含子，位于第454～512碱基处。
用BioEdit软件分析可知，PalF基因的cDNA序列双链核苷酸分子量大小为1 406.99 ku，（G+C）mol%为56.88%，（A+T）mol%为43.12%，可知该编码区富含GC碱基，其中G和C的摩尔百分含量分别为27.53%和29.35%。
2.2.2 PalF基因蛋白的理化性质分析和同源性分析 用ProtParam工具（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）进行分析可知，推测的PalF基因编码769个氨基酸，分子量大小为 83.05 ku，其中，酸性氨基酸有107个，碱性氨基酸有79个，等电点（PI）为5.27，富含丝氨酸（10.5%）。其疏水性平均值（GRAVY）为-0.611。
用NCBI的Blast软件对PalF基因推测的氨基酸序列进行比对分析可知，该基因与草莓胶孢炭疽菌pH相关蛋白Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5（ELA35272.1）、鳄梨胶孢炭疽菌pH相关蛋白Colletotrichum gloeosporioides Cg-14（EQB45210.1）、萝菔炭疽菌pH相关Arrestin蛋白Colletotrichum higginsianum arrestin（CCF33501.1）、黄瓜炭疽菌pH相关Arrestin蛋白Colletotrichum orbiculare MAFF 240422（ENH88457.1）基因编码蛋白序列同源性较高，相似性达到85%以上。与香蕉尖孢镰刀菌pH调节相关蛋白PalF/RIM8 Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4（EMT62111.1）、棉花黄萎病菌pH调节相关蛋白PalF/RIM8 Verticillium dahliae VdLs.17（EGY22961.1）基因编码蛋白序列同源性为50%以上，主要变异存在于蛋白的N端。推测该基因为pH调控相关蛋白。
用ClustalX 1.81和MGEA4.0.1PalF软件对芒果胶孢炭疽菌PalF蛋白与其他真菌pH调控相关阻遏蛋白构建系统发育树，结果表明：该蛋白与同属的草莓胶孢炭疽菌、鳄梨胶孢炭疽菌、黄瓜炭疽菌、萝菔炭疽菌、禾生炭疽菌聚为一类，其中与草莓胶孢炭疽菌的亲缘关系最近（图3）。由此推测PalF基因属于pH调控相关蛋白一类。
2.2.3 PalF基因蛋白的推测保守结构域分析 用NCBI Blast软件对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析（图4），可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域，说明该蛋白属于阻遏蛋白家族。
2.2.4 PalF基因蛋白的跨膜区分析 用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析（图5），可知PalF无明显的跨膜区，不可能是膜上的受体或定位于膜上。
3 讨论与结论
环境pH感应信号转导途径参与调控真菌的致病性已经在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、油梨炭疽病（Collletotrichum gloeosporioides）以及酸橙炭疽病（Collletotrichum acutatum）、芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等多种病原病害系统中得到了深入的研究[3，8]。在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，环境pH信号途径组件PalF含有两个具阻遏蛋白特性的N-端和C-端结构域，这个结构域可以与推测的pH感受器PalH，即一种7-跨膜受体（7TM）C端细胞质尾的两个不同区域牢固结合。在碱性环境中，PalF以一种依赖信号和7TM依赖的方式被磷酸化和泛素化。PalF N-端一个高度保守的丝氨酸残基如果被取代突变，即可阻止PalF和PalH之间的互作和pH信号传递[9]。敲除稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）PalF基因的突变体的致病力显著降低[5]。在芒果胶孢炭疽病菌中，敲除PalF基因的突变体是否影响芒果炭疽菌的致病力还未见报道，因此需要从芒果炭疽菌中克隆PalF基因，为进一步研究该基因对芒果炭疽菌致病力的影响奠定基础。 本研究采用同源克隆的方法克隆了芒果炭疽菌的pH调控相关基因PalF，经序列分析可知与橡胶胶孢炭疽菌的PalF基因的同源性达到100%；经过Blastp比对得知该基因与pH相关Arrestin蛋白的相似性达80%以上。目前研究结果表明丝状真菌中环境pH感应信号转导途径中Arrestin蛋白多为PalF基因编码的蛋白[6，9]。与香蕉尖孢镰刀菌、水稻恶苗病菌、棉花黄萎病菌的pH相关蛋白palF的相似性为50%，该类基因的C-端非常保守，而N-端则存在较大变异。可以推断克隆的该基因为目的基因PalF。在获得PalF基因cDNA序列的过程中，采用了半巢式PCR的方法进行了鉴定，经比对结果证实该基因只含有一个大小为59 bp的内含子。
根据本实验获得的PalF基因序列，进一步构建了基因敲除载体，旨在获得其基因功能丧失突变体，通过致病性测定芒果胶孢炭疽菌PalF基因在环境pH感应信号转导途径中的调控作用。
参考文献
[1] Ploetz R C， Benscher D， Vazquez A， et al. Research in Florida on an apparently wide-spread disease complex. Proc[J]. Int. Mango Sympos. 5th.Acta Hortic， 1996， 455： 547-553.
[2] Penalva M A， Arst H N J. Recent advances in the characterization of ambient pH regulation of gene expression in filamentous fungi and yeasts[J]. Annu. Rev. Microbiol， 2004， 58： 425-451.
[3] Penalva M A， Arst H N J. Regulation of gene expression by ambient pH in filamentous fungi and yeasts[J]. Microbiol. Mol. Biol. Rev， 2002， 66： 426-446.
[4] Hervas Agruilar， Antonio Galindo， Migule A Penalva. Recepter-independent Ambient pH Signaling by Ubiquitin Attachment to Fungal Arrestin-like PalF[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2010， 23： 18 095-18 102.
[5] Walter Maccheroni Jr， Gregory May S， Nilce M Martinez-Rossi， et al. The sequence of palF， an environmental pH response gene in Aspergillus nidulans[J]. Gene， 1997， 194： 163-167.
[6] Treton B， Blanchin-Roland S， Lambert M， et al. Ambient pH signalling in ascomycetous yeasts involves homologues of the Aspergillus nidulans palF and palH[J]. Molecular and General Genetic， 2000， 263（3）： 505-513.
[7] 张 欣. 应用RAPD技术区别芒果抗炭疽病品种的研究[J]. 中国生态农业学报， 2005， 13（4）： 20-21.
[8] 蒲金基. 胶孢炭疽菌环境pH感应信号转导途径参与调控其对芒果的致病性[D]. 海口： 海南大学， 2008.
[9] Silvia Herranz， Jose M Rodriguez， Juan C Sanchez-Ferrero， et al. Arrestin-related proteins mediate pH signaling in fungi[J]. Pnas， 2005， 34： 12 141-12 146.
关键词 芒果；胶孢炭疽菌；pH信号转导途径
中图分类号 Q78 文献标识码 A
Cloning and Characterization of Ambient pH Signal
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2 Environment and Plant Protection College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
Abstract Based on the complete genome sequence of Colletotrichum gloeosporioides from Rubber and using the traditional homogene cloning method， PalF gene was cloned from C. gloeosporioides of Mango， and the objective gene fragment with the size of 2 369 bp were acquired. The gene sequence analysis showed that it included an intact open reading frame， and had 100% sequence homology with PalF gene of C. gloeosporioides from Rubber. The cDNA sequence of PalF gene obtained by RT-PCR had a length of 2 310 bp encoding a protein of 769 amino acid residues with one 59 bp intron. The analysis of conserved regions of amino acid sequence of PalF gene indicated that PalF protein contains a conservative domain of Arrestin-C， and presumed that PalF gene participated in the regulation of ambient pH-sensing signal transduction pathway which lays the foundation for further study of the gene on the role of ambient pH-sensing signal transduction pathway.
Key words Mango； Colletotrichum gloeosporioides； Ambient pH-sensing signal transduction pathway
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芒果炭疽病（Mango anthracnose），是目前影响芒果产量和品质最重要的病害之一。引起芒果炭疽病的主要病原菌为刺盘孢属胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides Penz（Penz.）Sacc.]。常造成叶斑、枝条回枯、落花落果，由于其潜伏侵染的特性，在采后贮藏过程中易造成果实腐烂[1]。在病原真菌与寄主互作过程中，寄主组织对环境pH信号具有调控作用，而病原真菌则通过环境pH感应信号转导途径（Ambient pH-sensing signal transduetion pathway）以对不同寄主的pH环境信号作出响应[2-3]。丝状真菌中环境pH感应信号转导途径由pacC、palA、palB、palC、palF、palH和palI 7个基因介导[3]，其中，环境pH信号转导途径通过对转录因子pacC的介导实现相关基因的表达调控；palB有可能是信号依赖性蛋白水解酶，在环境pH信号转导途径中起到催化作用；palA参与palB对pacC的水解；palH和palI分别有7个和4个推测的跨膜结构域，推测起着感受环境pH的作用；palI在环境pH信号转导途径中起到的作用目前还不清楚[3]。PalF蛋白帮助协助palH蛋白在膜上的定位[4]，PalF基因编码蛋白是一种阻遏蛋白（Arrestin），在碱性条件下负责激活转录激活因子pacC，这种对碱性pH的应答是由保守的信号途径RIM101途径控制[5-6]。然而，目前在芒果胶孢炭疽菌系统中尚未开展关于palF基因有关的研究，为了明确palF基因在pH感应信号转导途径中的作用，本研究克隆了胶孢炭疽菌环境pH信号调控基因palF，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 1 材料与方法
1.1 供试菌种和试剂
试验所需的芒果胶孢炭疽菌A2由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带果树病害课题组提供。Recombinant Taq polymerase、pMD18-T Vector、E.coli Competent Cells DH5α、Prime Script High Fidelity RT-PCR Kit均购自宝生物工程（大连）有限公司；Fungal RNA Kit购自OMEGA公司。引物的合成和测序均委托英骏生物技术有限公司[Invitrogen Biotechnology（Shanghai）Co.，Ltd.]完成。
1.2 实验方法
2 结果与分析
2.1 芒果胶孢炭疽菌PalF基因的PCR扩增及克隆
根据胶胞炭疽菌（橡胶菌株）PalF基因设计引物同源扩增胶孢炭疽菌（芒果菌株）基因组DNA，得到1条预期的2 000多碱基的条带，进行切胶回收与克隆转化，测序结果表明片段大小为2 369 bp（图1）。用DNAman5.2软件与胶孢炭疽菌（橡胶菌株）PalF基因序列进行比对，分析结果表明，两者碱基序列同源性达100%。该基因序列已经提交至GenBank，序列登记号为KF479350。用芒果胶孢炭疽菌PalF基因PCR扩增的特异性引物来扩增PalF基因的表达序列，得到1条约2 300碱基的条带，进行切胶回收和克隆转化，测序结果表明大小为2 310 bp（图2）。
2.2 芒果胶孢炭疽菌PalF基因的序列分析
2.2.1 PalF基因的全长DNA和cDNA序列分析
用DNAman软件比对分析PalF基因的DNA和cDNA序列，发现PalF基因中含有1个大小为59 bp的内含子，位于第454～512碱基处。
用BioEdit软件分析可知，PalF基因的cDNA序列双链核苷酸分子量大小为1 406.99 ku，（G+C）mol%为56.88%，（A+T）mol%为43.12%，可知该编码区富含GC碱基，其中G和C的摩尔百分含量分别为27.53%和29.35%。
2.2.2 PalF基因蛋白的理化性质分析和同源性分析 用ProtParam工具（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）进行分析可知，推测的PalF基因编码769个氨基酸，分子量大小为 83.05 ku，其中，酸性氨基酸有107个，碱性氨基酸有79个，等电点（PI）为5.27，富含丝氨酸（10.5%）。其疏水性平均值（GRAVY）为-0.611。
用NCBI的Blast软件对PalF基因推测的氨基酸序列进行比对分析可知，该基因与草莓胶孢炭疽菌pH相关蛋白Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5（ELA35272.1）、鳄梨胶孢炭疽菌pH相关蛋白Colletotrichum gloeosporioides Cg-14（EQB45210.1）、萝菔炭疽菌pH相关Arrestin蛋白Colletotrichum higginsianum arrestin（CCF33501.1）、黄瓜炭疽菌pH相关Arrestin蛋白Colletotrichum orbiculare MAFF 240422（ENH88457.1）基因编码蛋白序列同源性较高，相似性达到85%以上。与香蕉尖孢镰刀菌pH调节相关蛋白PalF/RIM8 Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4（EMT62111.1）、棉花黄萎病菌pH调节相关蛋白PalF/RIM8 Verticillium dahliae VdLs.17（EGY22961.1）基因编码蛋白序列同源性为50%以上，主要变异存在于蛋白的N端。推测该基因为pH调控相关蛋白。
用ClustalX 1.81和MGEA4.0.1PalF软件对芒果胶孢炭疽菌PalF蛋白与其他真菌pH调控相关阻遏蛋白构建系统发育树，结果表明：该蛋白与同属的草莓胶孢炭疽菌、鳄梨胶孢炭疽菌、黄瓜炭疽菌、萝菔炭疽菌、禾生炭疽菌聚为一类，其中与草莓胶孢炭疽菌的亲缘关系最近（图3）。由此推测PalF基因属于pH调控相关蛋白一类。
2.2.3 PalF基因蛋白的推测保守结构域分析 用NCBI Blast软件对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析（图4），可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域，说明该蛋白属于阻遏蛋白家族。
2.2.4 PalF基因蛋白的跨膜区分析 用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析（图5），可知PalF无明显的跨膜区，不可能是膜上的受体或定位于膜上。
3 讨论与结论
环境pH感应信号转导途径参与调控真菌的致病性已经在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、油梨炭疽病（Collletotrichum gloeosporioides）以及酸橙炭疽病（Collletotrichum acutatum）、芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等多种病原病害系统中得到了深入的研究[3，8]。在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，环境pH信号途径组件PalF含有两个具阻遏蛋白特性的N-端和C-端结构域，这个结构域可以与推测的pH感受器PalH，即一种7-跨膜受体（7TM）C端细胞质尾的两个不同区域牢固结合。在碱性环境中，PalF以一种依赖信号和7TM依赖的方式被磷酸化和泛素化。PalF N-端一个高度保守的丝氨酸残基如果被取代突变，即可阻止PalF和PalH之间的互作和pH信号传递[9]。敲除稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）PalF基因的突变体的致病力显著降低[5]。在芒果胶孢炭疽病菌中，敲除PalF基因的突变体是否影响芒果炭疽菌的致病力还未见报道，因此需要从芒果炭疽菌中克隆PalF基因，为进一步研究该基因对芒果炭疽菌致病力的影响奠定基础。 本研究采用同源克隆的方法克隆了芒果炭疽菌的pH调控相关基因PalF，经序列分析可知与橡胶胶孢炭疽菌的PalF基因的同源性达到100%；经过Blastp比对得知该基因与pH相关Arrestin蛋白的相似性达80%以上。目前研究结果表明丝状真菌中环境pH感应信号转导途径中Arrestin蛋白多为PalF基因编码的蛋白[6，9]。与香蕉尖孢镰刀菌、水稻恶苗病菌、棉花黄萎病菌的pH相关蛋白palF的相似性为50%，该类基因的C-端非常保守，而N-端则存在较大变异。可以推断克隆的该基因为目的基因PalF。在获得PalF基因cDNA序列的过程中，采用了半巢式PCR的方法进行了鉴定，经比对结果证实该基因只含有一个大小为59 bp的内含子。
根据本实验获得的PalF基因序列，进一步构建了基因敲除载体，旨在获得其基因功能丧失突变体，通过致病性测定芒果胶孢炭疽菌PalF基因在环境pH感应信号转导途径中的调控作用。
参考文献
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