通常消费化妆品无需担心生殖和发育毒性的问题，但是近年来塑化剂、双酚A等具有潜在生殖毒性的化合物引起的安全事件频繁发生，使消费者对于长期使用化妆品的安全性越来越担忧。一方面是化妆品质量参差不齐，消费者担心各种非法添加和禁限用物质的超标使用，另一方面，受制于传统评估方法的局限，人们对大量新化合物的长期慢性毒性根本来不及评估，因认识不足而加剧这种担扰。因此，开发低成本高通量新的体外方法并与体内动物实验整合运用可提高化妆品原料生殖与发育毒性的安全性评估与科学认知。
　　生殖是使种族延续的各种生理过程的总称，包括配子（精子与卵子）发生、交配、卵细胞受精、着床、胚胎形成与发育、胎仔发育、分娩和哺乳等阶段。生殖毒性指的是一种物质在繁殖周期的任何一个阶段中所产生的毒副作用，既包括外源物质对亲代生殖功能的影响，也包括对子代发育过程的有害影响。如今年以来愈演愈烈的塑化剂事件，导致危机的邻苯二甲酸酯类就属于对生殖发育的各个阶段均有可能产生危害瓦特的一类化合物。研究表明邻苯二甲酸酯类在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，可干扰内分泌，影响男性生殖系统的功能，严重的会导致睾丸癌。动物实验表现为肾脏和睾丸重量减轻、流产、胚囊植入率降低、多脏器发育畸形。邻苯二甲酸酯类普遍存在于化妆品中，指甲油的邻苯二甲酸酯含量最高，很多化妆品的芳香成分也含有该物质。化妆品中的这种物质会通过女性的呼吸系统和皮肤进入体内，如果过多使用，会增加女性患乳腺癌的几率，还会危害到她们未来生育的男婴的生殖系统。因此，日化工业的高速发展不能忽视可能日趋严重的生殖和发育毒性危害。
　　生殖毒性的动物实验
　　化学物的生殖发育毒性有两个显著的特点：一是生殖系统较机体的其他系统对化学物的毒作用更为敏感，二是损害作用不仅影响接触化学物质的母体本身，还可影响其后代。鉴于哺乳类动物繁殖过程的复杂性，对繁殖过程的各个方面进行毒理学分析都是必须的，包括致畸性、内分泌干扰、母细胞突变、生育受损等。为了检测化学物质对生殖周期内不同靶细胞/器官的毒副作用，OECD发布了8个试验指导，这些指南大多数是动物实验方法。2009年OECD认可了TG 455（雌二醇受体转录试验），这是首个发布的生殖毒性试验替代方法。还有3项体外试验方法已完成验证，进入法规认可程序。发育和生殖毒性的试验标准还见于美国试验和材料学会（ASTM）、美国环保局（USEPA）等的方法指南中。
　　传统的生殖毒性检测以动物试验为主，包括分娩前发育毒性研究（OECD TG 414）、一代动物毒性研究（OECD TG 415）、二代动物毒性研究（OECD TG 416）、生殖毒性/发育毒性筛选检测（OECD TG421）、重复剂量毒性研究结合生殖毒性/发育毒性筛选检测（OECD TG 422），以及2009年发布的Hershberger试验（TG411）和目前正在讨论中的发育神经毒性试验（TG426）。我国列入各类商品（药品、食品、药妆品、化学品）毒性测试指南的标准方法均来源于OECD。完整的生殖毒性研究应包括成年动物从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物的反应。测试时间应连续通过一个完整的生命周期，即从亲代受孕到子一代受孕。最常用的三段生殖毒性试验由生育力和早期胚胎发育毒性试验、胚体—胎体毒性试验（致畸试验）和出生前后发育毒性试验（围产期毒性试验）三部分组成。对于人类反复接触的化学物，如食品添加剂、农药、环境污染物及某些化妆品原料等，仅做三段生殖毒性试验是不够的，应进行多代生殖试验。
　　2008年OECD提出了一项新的试验指南，称为延长一代生殖毒性研究，用于代替一代和二代动物毒性研究（OECD 415，416）以及其它特定发育毒性研究（OECD 426，414）。试验设计体现了3R法规的要求，更加灵活和有效，优化了实验过程和检测指标，增加了发育神经毒性和免疫毒性的评价，减少了动物使用。
　　体外替代方法的研究策略
　　鉴于哺乳类动物繁殖过程的复杂性，试图通过体外系统模拟整个繁殖周期来检测某种化合物的生殖毒性还不可能。因此，将整个繁殖过程分成数个连续的生物学部分，分别对其进行单独或联合研究，可最大化鉴定出某种物质的靶细胞、组织或器官。根据这一思路，已建立了许多有前景的体外模型和方法。例如内分泌干扰物的筛查方法、报告基因检测方法、计算机辅助精子检测方法等。这些体外方法的组合应用有助于生殖毒性的安全性评价和机制研究。
　　
　　1. 雄性和雌性繁殖力和受精方面
　　目前研发的方法覆盖了许多毒性作用终点，如睾丸支持细胞和生精细胞毒性，卵泡发生（FBA检测），生殖细胞成熟，精子运动性和形态学（CASA检测），精子DNA损伤（ReProComet检测），甾体生成（FBA和粒层细胞检测），内分泌系统干扰（MELN，CALUX、PALM试验），授精（小鼠和牛体外授精检测），着床前胚胎发育（小鼠和牛体外着床前检测），胎盘形成（绒毛膜和周边细胞培养，胎盘表面灌注，滋养层细胞检测），子宫功能（内膜、血管膜、基质细胞和移植物检测）等。目前，比较成熟的体外试验方法约有15项，涉及生殖和发育毒性的多个方面。
　　2. 着床方面
　　由于化学物质可能损伤着床过程，进而造成其它生殖系统异常，因此，着床毒性作用研究是生殖毒性的重要方面。体外方法主要集中于对离体人组织和组织移植物的研究，其中最重要的靶组织是子宫内膜，其次是毛细血管内皮细胞。此外还可利用人胎盘进行化合物的转运研究。
　　 3. 胚胎发育方面
　　现有的方法是全胚胎培养（W E C）、小鼠胚胎干细胞试验（EST）和微团试验。小鼠EST试验以分化为博动的心肌细胞为检测终点。欧洲一些科学家提出了用人的胚胎干细胞（hES）用于检测神经发育毒性物质的替代方法，避免了因毒性反应的种间差异引起的化学物错误分类。关于着床机制的数学模型也取得了进展，QSAR模型开发用于预测化学物的胎盘转移、可能的内分泌紊乱活性作用和代谢方式等。毒性基因组学结合功能性指标（如表型锚定）用于评价受体介导以及分化过程中基因表达变化的相关性和一致性。
　　已验证的生殖和发育毒性替代方法
　　20 03年，三项胚胎毒性替代试验通过了欧洲替代方法验证中心（ECVAM）的验证，这些实验是：用于检测胚胎毒性的全胚胎培养试验（WEC）、微团培养试验（MM）和胚胎干细胞试验（EST）。2009年雌二醇受体转录试验被OECD认可为指南TG 455，用于内分泌干扰物筛查。这些方法不仅可用于筛选试验，还可用于发育机制的研究，或作为试验策略的组成部分，或与整体动物试验相结合，或与其它体外试验相结合，提供有价值的资料，减少实验动物使用。
　　 1. 雌二醇受体转录检测
　　雌二醇受体（ER）是一个诱导靶基因转录的转录因子，利用ER的这一特性，将雌二醇受体调控的DNA序列与容易检测的报告基因连接起来，这样可以直接对雌激素类化合物进行筛选。如MCF-7、Hela、HepG等细胞均可作为转染载体成为检测细胞。体外雌二醇受体转录检测（TAs）主要用来鉴定在体内具有激动剂或拮抗剂效应且能够影响雌二醇活性的化合物。2009年被OECD认可的指南455使用来自人的宫颈癌并经稳定转染的细胞系hERa-HeLa-9903，细胞暴露于非细胞毒性浓度的受试物20～24小时以诱发报告基因的产生，每个试验同时检测4种参考化学物质，强雌激素（17-β雌二醇）、弱雌激素（17-α雌二醇）、极弱雌激素（17-α-甲基睾酮）和阴性对照（皮质甾酮）。荧光素酶活性的测定采用液闪仪。如果诱发的最高反应相当或超过阳性对照（1 nM 17-α-雌二醇）反应的10%则可判定为阳性物质。
　　 2. 胚胎干细胞试验（EST）
　　Laschinski等于1991年将ES细胞用于体外致畸实验研究，通过比较化合物对ES细胞和小鼠成纤维细胞的细胞毒性，对致畸物的胚胎毒性进行评估。Heuer等于1994年首次将ES细胞的分化过程用于胚胎毒性的检测。1997年德国动物试验替代方法评价中心（ZEBET）Spielmann等首次建立了利用小鼠细胞系（成纤维细胞3T3和胚胎干细胞D3），确立了两种细胞三个检测终点的胚胎干细胞实验法。之后，经过方法优化，2003年完成全部验证过程，被ECVAM认可为替代动物胚胎毒性试验的方法，该方法广东检验检疫局已将其转化为行业标准并用于日常检测。
　　
　　 3. 全胚胎培养试验（WEC）
　　来源于小鼠、大鼠和兔等哺乳类动物的胚胎培养可用于检测具有发育毒性的物质。大鼠全胚胎培养是从孕期第9～10天大鼠子宫取出胚胎，剥去Reichert膜，放入培养液中加入受试物，在含O₂、CO₂和N₂环境中旋转培养。观察胚胎发育情况，记录胚胎存活，检测胚芽、卵黄囊直径、体节和体长等情况。以胚胎的心跳和血液循环是否存在作为胚胎存活的指标；以卵黄囊直径、颅臀长和头长、体节数和胚胎重作为胚胎生长发育的指标；根据Brown评分对器官形态分化作出评价。该方法可用于筛查化学物的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制。
　　4. 微团培养
　　微团培养（MM）比全胚胎培养简单得多，胚胎肢芽细胞可取自鸡、兔或大、小鼠，细胞一般分离自器官形成中期胚胎的肢体或头部组织。制成单细胞悬液后，以高密度接种培养，通过分析受试物暴露后细胞分化情况，对确定的毒理学终点进行检测。微团培养模型可用于体外观察细胞生长发育和分化，探索外源性化合物的致畸作用、细胞毒性作用及作用机理研究。
　　生殖和发育毒性的替代方法
　　
　　 1.计算机辅助精子检测
　　计算机辅助精子检测（CASA）是通过观察化学物质对牛精子细胞的毒副作用，评估化学物对雄性生殖力的影响。试验前先进行剂量范围确定试验，然后计算IC50（与对照相比，精子总的运动性下降50%的化学物浓度），还包括对精子的生育能力、生存能力、活力、速率、活动、精液形态学等检测指标作实时分析。CASA方法类似于男性的临床生殖体检，系统可自动得出系列参数，如曲线速度、直线速度、平均路径速度、精子头侧摆幅度、平均移动角度等，用于检测结果描述和判定。
　　 2.睾丸间质细胞毒性试验
　　睾丸间质细胞（Leydig细胞）分布于生精小管之间的疏松结缔组织中，其主要功能是分泌睾酮。睾丸Leydig细胞分泌睾酮受到丘脑－垂体－性腺轴的调节。研究表明，外源化学物质会直接损伤莱迪希细胞影响睾酮分泌。运用体外培养的Leydig细胞，检测受试物作用后睾酮分泌量，该方法可作为实验策略的组成单元，用于雄性生殖毒性的筛查和机制研究。
　　 3.睾丸支持细胞毒性试验
　　睾丸支持细胞（Sertoli细胞）是生精小管的主要细胞，对精子的发生非常重要，支持细胞能合成和分泌多种活性蛋白质和多肽因子，如抑制素、激动素、雄激素结合蛋白等。体外培养的Sertoli细胞，用不同浓度的化学物作用，检测细胞活性和功能变化，可用于评价化学物对睾丸支持细胞的毒性作用。可用两种细胞系统进行试验，大鼠原代Sertoli细胞和Sertoli细胞系（SerW3）。细胞在37℃培养形成单层，直接将不同浓度的受试物加入细胞培养液中孵育2～24小时。孵育结束后吸出培养基，试验终点包括细胞毒性（MTT法）、培养液中抑制素B水平测定（ELISA法）、计算EC50的值、判断化学物对Sertoli功能的影响。
　　 4.颗粒细胞甾体生成试验
　　颗粒细胞甾体生成试验用于检测雌性生殖毒性，细胞可选用永生化的小鼠颗粒细胞系NT-1和变异株NT-1- hAROM（表达人芳香化酶基因），研究受试物对颗粒细胞甾体生成水平的影响。如检测对孕酮生成的影响，可将NT-1细胞与不同浓度受试物孵育，免疫法测定上清液中孕酮含量，贴壁细胞进行细胞毒性测定（MTT检测）。如检测对雌二醇生成的影响，可将NT-1-hAROM细胞与芳香化酶的底物雄烯二酮共孵育，酶联免疫法测定培养液中雌二醇的产量，贴壁细胞进行细胞毒性测定（MTT检测）。
　　 5.卵泡培养检测
　　卵细胞的生长和发育依赖于其周围支持细胞的健康与发育状况（即卵泡的形成）。在卵泡的漫长生长过程中，其组成部分在各个发育阶段对化学损伤都是非常敏感的，这些损伤使卵细胞质量下降，可能导致卵细胞减数分裂异常、受精失败或胚胎发育不良。卵泡检测（FBA）利用体外生长的卵泡试验系统模拟卵巢形态学特征，将其暴露于化学物，通过形态学、生物化学和功能指标检验分析化学物对卵泡发生、甾体形成和卵子发生的影响。可用于对卵巢功能具有抑制作用或激活作用的化学物的筛查，用于内分泌干扰物的筛查，以用于化合物干扰雌性生殖和受精能力的作用机制研究。可供检测的试验终点很多，如检测卵泡存活、分化和反应性（排卵感应性）；检测雄烯二酮/睾酮、雌二醇和孕酮水平；检测卵子产量、核成熟度和发育能力等。
　　 6.芳香化酶测试
　　芳香化酶具有将雄性激素转化成雌性激素的功能，卵巢和胎盘中该酶活性很高，而大部分的杀虫剂和黄体类似物都有抑制芳香化酶的活性。体外芳香化酶检测（Aromatase tests）通过测量芳香化酶对标记的雄烯二酮的代谢能力，判断受试物是否干扰芳香化酶的活性，可用于筛选环境干扰物质。目前有两种体外检测系统，分别是JEG-3和JAR绒毛癌细胞系。此外，还可以运用人类胎盘微粒体的体外亚细胞手段检测芳香化酶的活性。
　　 7.雌激素受体结合试验
　　雌激素受体结合试验用于检测能够与雌二醇受体（ER）结合的化合物。雌二醇受体是属于核激素受体超家族的转录调控蛋白，其在调控转录活化和/或抑制雌二醇应答基因方面发挥重要作用。雌二醇受体结合试验可检测雌激素激动剂和拮抗剂，但不能将二者区分。雌二醇受体体外竞争结合实验是通过定量检测受试物和17β-雌二醇与雌激素受体的竞争性结合能力，检测受试物是否能与ER结合发挥雌激素作用或干扰正常雌激素活性。雌激素受体结合试验可作为实验策略的组成部分，替代子宫增重动物实验。
　　 8.雄性激素受体结合试验
　　雄性激素受体结合试验是设计用来检测待测底物与雄性激素受体（AR）的亲和力。雄激素受体属于核激素受体超家族的一种转录调控蛋白，与甾体类激素受体家族的成员高度同源，这些成员包括黄体激素、糖皮质激素和盐皮质激素的受体。5α双氢睾酮（DHT）是雄激素受体的天然配体，一些外源化学物质可能通过模拟或阻断DHT发挥雄激素受体介导的内分泌干扰作用。如果外源化学物质的空间结构与DHT相似，就可能与雄激素受体结合或干扰DHT与雄激素受体的结合，从而导致正常生殖生理过程的紊乱。有些化学物可直接与雄激素受体结合，阻断DHT引发的细胞内过程，成为DHT拮抗剂。雄性激素受体亲和力检测能够检验出激动剂和拮抗剂，但不能区分两者。该试验方法可单独运用或作为试验策略的组成部分。
　　 9.雄性激素受体转录检测
　　与雌二醇受体转录检测（TAs）一样，雄性激素受体转录检测主要用来鉴定在体内具有激动剂或抗结剂效应而能够影响雄激素活性的化合物。这些检测方法都是以基因工程细胞系为基础，检测受雄性激素调控的报告基因产物（例如荧光素酶）。试验过程与雌二醇受体转录检测类似，成熟的方法经验证后有望通过OECD的认可。
　　结语
　　随着工业化的发展，人们的日常生活已被各种化学物质包围，越来越多的具有内分泌干扰毒性或生殖发育毒性的化学物质被科学实验证实，如双酚A、邻苯二甲酸酯类、壬基酚、尼泊金酯等常见于化妆品的物质。因此，在科学合理使用化学物质的同时，也应加强对这些物质可能存在的生殖毒性进行研究，特别是研发和应用快速、特异、敏感和高通量的方法。
　　可喜的是近年来国内外对这个领域越来越重视，国际社会加快了有效的体内或体外方法的标准化进程。此外，尚有不少体外检测方法有望在3-5年内转化成为预测外源物质生殖发育毒性的标准方法。当然也应认识到人类生殖发育过程的极端复杂性，有一些毒理学作用，如生殖行为、分娩、出生后的机能发育和促性腺激素的分泌的检测，即使是体内动物实验也没有统一的标准。因此，人类的生殖过程中，哪一个靶器官和生殖生理机制对化学物的损伤较为敏感，以及哪一个合适的体外模型能覆盖这一敏感范围，都必须进行评估和达成共识。只有那些科学性和相关性明确的方法才有进一步开发和验证的价值。
　　致谢：本项目得到广东省科技攻关项目的资助（2009B060300013）