目的:在DMEM培养液中仅含20%国产小牛血清,而无其他生长因子制剂添加的前提下,对兔、成人及胎儿的角膜内皮细胞进行分离培养。方法:显微分离兔角膜后弹力层—内皮细胞层,在含0.25%胰酶及0.02%EDTA的D-Hanks液中37℃消化5分钟后,换用0.1%胶原酶35℃继续消化1.5～2小时,离心获得的细胞进行培养。显微分离人后弹力层—内皮细胞层后,贴壁进行培养。培养液为DMEM,含20%国产小牛血清。结果:免内皮细胞4周后呈密集单层生长,1:2传代培养生长良好。光镜与电镜证实,培养的兔角膜内皮细胞具有活体细胞的形态特征。贴壁法成人及胎儿角膜内皮细胞培养中发现,成人及胎儿角膜内皮细胞均可移行生长,而胎儿的角膜内皮细胞较难分离纯化。结论:显微分离—酶消化法免角膜内皮细胞培养获得成功,使我们得到大量生长良好的细胞可用于角膜内皮细胞移植动物试验;成人及胎儿角膜内皮细胞培养的尝试,为今后进一步开展人角膜内皮细胞培养与移植研究提供了可借鉴的经验。