【摘 要】
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目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方
【机 构】
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重庆医科大学附属第二医院感染科、教育部感染性疾病分子生物学重点实验室
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目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基因重组技术,从重组质粒p PIC9K-rh ALR中扩增出编码rh ALR基因片段,将其克隆入p PICZαA质粒中构建重组质粒p PICZα-A-rh ALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rh ALR体外对人肝癌细胞(Hep G2、QGY)的促增殖活性,及流式细胞仪检测rh ALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果:PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rh ALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 k D,Western blot均可见单一条带。纯化后的rh ALR对Hep G2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强(Hep G2组:F=246.729,P=0.000;QGY组:F=246.004,P=0.000),且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用(F=101.061,P=0.000)。结论:成功构建高效分泌表达rh ALR的p PICZα-A-rh ALR GS115真核表达系统;体外实验证实rh ALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。
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