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【摘要】 目的 了解10类食品中阪崎肠杆菌的污染状况及污染数量，评估其风险性，为预防和控制阪崎肠杆菌的感染、传播、流行提供科学依据。方法 按照GB4789.1-2010采抽样技术、GB4789.40-2010《食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》、实时荧光PCR法操作规程，对10类850份食品进行阪崎肠杆菌检验，标准菌株作对照。结果 检出阪崎肠杆菌54株，总检出率为6.4%。该10类食品阪崎肠杆菌的检出率差异有统计学意义，由高至低排序为：冰淇淋＞巧克力坚果＞熟肉＞糖饼类＞面包糕点＞方便面＞奶类＞饮用水、生肉、调味品。染菌量＞30 MPN/100g(ml)以上的有15份，占27.7%(15/54)。结论 10类食品检出阪崎肠杆菌的有7类，应予以重视。
【关键词】 阪崎肠杆菌； 定性； 定量
Investigation of 10 kinds of food be poluted by Enterobacter sakazakii LU Xing-er，ZHENG Yue-kang，WU Can-quan.Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province，Zhongshan 528403，China
【Abstract】 Objective To understand the contamination of Enterobacter sakazakii and the amount of pollution from 10 kinds of food，assess their risk，to provide the scientific basis for control and prevent infection，communication and prevalence of Enterobacter sakazakii.Methods The samples were tested in accordance with the national standard and real-time fluorescence PCR method.The samples were tested from 850 samples of 10 kinds of food.Standard strain was used as control.Results The 54 strains of Enterobacter sakazakii were detected,the detection rate was 6.4%.There was statistically significant difference in terms of 10 kinds of food.The order from high to low was：ice cream>chocolate nut>cooked meat>candy cake>bread，pastry>instant noodles>milk>water，condiment，raw meat.15 samples were contaminated volume over>30 MPN/100g(ml) concentration range，accounting for 27.7%（15/54）.Conclusion Enterobacter sakazakii were detected from 7 of 10 kinds of food.We should be targeted to strengthen supervision and management.
【Key words】 Enterobacter sakazakii； Qualitative； Quantitative
据WHO最新报告显示，乳粉中的阪崎肠杆菌是导致婴幼儿感染和死亡的主要原因之一。早在2002年国际食品微生物标准委员会就将阪崎肠杆菌列为对特定人群产生严重的生命危害、或产生慢性后遗症的微生物，可见其危害［1］。然而，一项近期的研究结果表明，阪崎肠杆菌是一种广泛存在的微生物，不仅能够存在于污染的食品和食品工厂当中，而且在家居环境和几乎所有的环境中均能够分离得到［2］。为主动掌握阪崎肠杆菌的污染状况及分布趋势，本研究展开了对10类食品的摸底调查。该10类食品基本包括市面上销售的主要食品，有国产的也有进口的，有本地的也有外地的，有生的也有熟的，有国家级省级名牌，也有本地区名优食品等。对公共卫生领域中的监管和预警，对推进社会的科学发展，弘扬本土的饮食文化，起着积极的作用。
1 材料与方法
1.1 样品采集 兼顾到城区和乡镇、东南西北各方位，2010年7月~2010年12月样品采抽于大型商场、超市、农贸市场、酒店、餐馆、小吃店、快餐店、饼铺、士多店等共20个区镇328家销售的10类食品，分别有奶类、糖饼类、面包蛋糕、熟肉制品、饮用水、调味品、方便面、生肉、冰淇淋、巧克力坚果等共850份。原则上要求同类食品品牌不重复，优先抽取本地产品、具地方特色产品和消费量较大的产品，包装完整、保质期内。每份样品抽双份，一份为送检样，一份为留样。
1.2 主要培养基与试剂 BPW、mLST-Vm 、DFI、TSA购于北京陆桥；阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测试剂盒购于深圳太太基因工程有限公司；氧化酶试剂购于广州千江有限公司；G阴性板、ID肉汤购于美国BD，均在有效期内使用。
1.3 标准菌株 阪崎肠杆菌ATCC51329购于广东环凯微生物科技有限公司。
1.4 检测仪器 美国BD PHOENIX 100全自动细菌鉴定药敏系统；美国OPTICON2实时荧光定量检测仪；日本奥林巴斯BX51T-32H01系统显微镜。
1.5 方法 国标法、实时荧光PCR法同步进行，标准菌株作对照。
1.5.1 国标法 样品处理按GB4789.40-2010《食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》进行。mLST-Vm肉汤培养液增菌后，挑取1环划线于DFI显色平板，（36±1）℃培养（24±2） h。挑取1～5个呈圆形、蓝绿色，直径为1～2mm的可疑菌落作革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定(选用美国BD PHOENIX 100全自动细菌鉴定药敏系统)，接种TSA平板观察黄色色素，综合菌落形态和生化特征报告检测结果。定性检出阪崎肠杆菌后作MPN值计数。
1.5.2 实时荧光PCR法 样品处理按国标法进行。接mLST-Vm肉汤培养液增菌后，取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000rpm离心5min，弃上清液。加入50μl核酸溶解液，混匀后沸水浴5min，13000rpm离心5min，取上清液待检。然后按试剂盒说明书操作，根据检测样品Ct值报告阳性或阴性结果。
2 结果
2.1 （1）奶类100份包括液态奶、奶饮品60份和奶粉、婴幼儿米粉40份，其中有1份奶饮品和1份婴幼儿米粉检出阪崎肠杆菌。（2）糖饼类175份包括饼干酥角等110份、杏仁饼30份、糖果35份，依次检出阪崎肠杆菌株数为1、12、1。（3）巧克力坚果80份包括巧克力50份、坚果30份，依次检出阪崎肠杆菌株数为2、9。（4）方便面包括杯面、袋装面40份，检出阪崎肠杆菌2株。（5）冰淇淋30份（因抽检时间安排在冬天，大部分商品已退出市场，抽检件数稍小）检出阪崎肠杆菌6株。（6）饮用水83份包括500ml等小瓶装和18.9 L大桶装，实时荧光PCR法2份阳性。（7）152份熟肉制品分5类：叉烧排骨、卤肉、烧肉、烧鸡鸭鹅、油鸡切鸡等检出阪崎肠杆菌14株。（8）面包糕点类含速冻包子馒头和即食糕点等80份，检出阪崎肠杆菌5株。
2.2 生肉和调味品采用国标法、实时荧光PCR法均未检出阪崎肠杆菌。
3 讨论
3.1 阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii)是人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性无芽胞杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，一直被称为黄色阴沟杆菌（yellow pigmented enterobacter cloacae）。而阴沟杆菌则是食品卫生质量指标中大肠菌群的指示菌之一，阪崎肠杆菌的存在直接影响大肠菌群MPN值，本研究曾在检出的54株阪崎肠杆菌中随机抽取20株作大肠菌群测定，均显示阳性结果。
3.2 阪崎肠杆菌对营养的要求不高，耐热耐寒耐高温，对清洁剂杀菌剂有较强的抵抗力，是一种普遍存在的微生物［3，4］。本研究数据显示，10类食品当中有7类检出阪崎肠杆菌，可见阪崎肠杆菌存在的广泛性。其中冰淇淋、坚果、杏仁饼（地方特色食品）和熟肉检出率较高，染菌量也较浓（见表2，表3），可能与加工制作过程或工艺流程有关，存在一定的致病风险，应引起警惕。
未检出阪崎肠杆菌的3类食品分别是饮用水、调味品、生肉。（1）直接饮用水中存在该菌的数量甚少，83份水样品国标法均未检出，只有实时荧光PCR法2份阳性；（2）50份调味品包括酱油、醋、青芥辣、辣酱、复合调味料，具有酸、甜、苦、辣、咸等各种味道的特点，还含有各式各样添加剂、防腐剂，酸碱度不同，不利于阪崎肠杆菌的生长；（3）60份生肉包括禽肉、畜肉、鱼虾贝类3种，在分离培养过程中发现有较多的干扰菌，分别检出普通/彭氏变形杆菌16株、奇异变形杆菌1株、大肠埃希氏菌1株，共17株。这些干扰菌在分离平板上呈优势生长，是否抑制了阪崎肠杆菌，有待进一步探讨。
3.3 阪崎肠杆菌虽然广泛存在于自然界，但食品中的染菌量一般不高。本研究定量结果发现，染菌量在30 MPN/100g(ml)浓度范围以下的占72.3%（39/54），其中有7份样品检验结果为＜0.3 MPN/100g(ml) (曾作重复试验)，不同部位取材、分布不均，或污染量甚微所致。也就是说大多数食品中阪崎肠杆菌的存在量较少，分布又非常不均匀，检验时必须采用大量、均匀的样品接种，才有可能覆盖到该菌的污染。可见阪崎肠杆菌国标法MPN/值计数所规定的样品用量333g(ml)，较其他致病菌25g(ml) 用量高的合理性。
3.4 两种方法对比 实时荧光PCR法检测时间短，灵敏度高，是初筛的好方法，而国标法则是报告结果的依据。本研究所采用实时荧光PCR法试剂盒的灵敏度为102-103copies/ml，国标法定性检出限是每100g（ml）样品检出或未检出阪崎肠杆菌。检测结果是PCR法阳性率为7.4%（63/850），国标法检出率为6.4 %（54/850）。即850份样品中有841份国标法和实时荧光PCR法检测结果一致，9份不同。日常工作中，也时而遇到实时荧光PCR法阳性而国标法未检出的事例，如沙门氏菌、副溶血性弧菌、出血性大肠埃希氏菌O157等的检验都有所见。当国标法未检出而PCR法阳性时应反复分离培养，以防漏检。总之两种方法同步使用可提高检测结果的可靠性。
3.5 方法探讨 （1）阪崎肠杆菌检验国标法全过程需要6d，增菌培养3d后如直接采用DFI平板上的纯菌落（或再分纯1d）作生化鉴定，可缩短1~2d检测时间。也可同时接种TSA平板观察黄色色素，即生化鉴定和色素观察同时进行，两不误。（2）850份样品按国标法进行分离培养，在操作过程中发现： DFI显色平板上的阪崎肠杆菌菌落与多种干扰菌的菌落较为相似，均呈圆形、蓝绿色、大小1～3mm。分别是普通/彭氏变形杆菌24株、肺炎克雷伯氏菌5株、非脱羧勒克氏菌3株、成团肠杆菌2株、奇异变形杆菌1株、大肠埃希氏菌1株、伤口埃希氏菌1株、日沟维肠杆菌1株、塞氏枸橼酸杆菌1株，共39株，详细见表1。通过划线于TSA平板、生化鉴定、PCR法可以区分。（3）检验全过程关键控制点是培养温度，分别有3种：36℃、44℃、25℃，须严格把关，否则直接影响检验结果。点滴体会仅供参考，希望能起抛砖引玉的作用。
本研究在检出的54株阪崎肠杆菌菌株中随机抽取16株（约1/3量）上送省级主管部门确证，结果反馈准确率达100%。
参考文献
［1］鲁曦，师宝忠，王彬等.LAMP法检测乳粉中的阪崎肠杆菌.现代食品科技，2010，26(5)：540-543.
［2］Leclercq A，Wanegue C，Baylac P，et al.Comparison of Fecal Coliform Agar and Violet Red Bile Lactose Agar for Fecal Coliform Enumeration in Foods.Applied and Environmental Microbiology，2002，68(4)：1631-1638.
［3］张雪梅，孙鑫贵，卢阳等.阪崎肠杆菌的研究进展.中国乳品工业，2008,36（3）：42-46.
［4］梁鹰，王红戟.阪崎肠杆菌研究进展.中国微生态学杂志，2008,20（4）：418-420.
（收稿日期：2011-04-06）
（本文编辑：梅宏伟）
【关键词】 阪崎肠杆菌； 定性； 定量
Investigation of 10 kinds of food be poluted by Enterobacter sakazakii LU Xing-er，ZHENG Yue-kang，WU Can-quan.Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province，Zhongshan 528403，China
【Abstract】 Objective To understand the contamination of Enterobacter sakazakii and the amount of pollution from 10 kinds of food，assess their risk，to provide the scientific basis for control and prevent infection，communication and prevalence of Enterobacter sakazakii.Methods The samples were tested in accordance with the national standard and real-time fluorescence PCR method.The samples were tested from 850 samples of 10 kinds of food.Standard strain was used as control.Results The 54 strains of Enterobacter sakazakii were detected,the detection rate was 6.4%.There was statistically significant difference in terms of 10 kinds of food.The order from high to low was：ice cream>chocolate nut>cooked meat>candy cake>bread，pastry>instant noodles>milk>water，condiment，raw meat.15 samples were contaminated volume over>30 MPN/100g(ml) concentration range，accounting for 27.7%（15/54）.Conclusion Enterobacter sakazakii were detected from 7 of 10 kinds of food.We should be targeted to strengthen supervision and management.
【Key words】 Enterobacter sakazakii； Qualitative； Quantitative
据WHO最新报告显示，乳粉中的阪崎肠杆菌是导致婴幼儿感染和死亡的主要原因之一。早在2002年国际食品微生物标准委员会就将阪崎肠杆菌列为对特定人群产生严重的生命危害、或产生慢性后遗症的微生物，可见其危害［1］。然而，一项近期的研究结果表明，阪崎肠杆菌是一种广泛存在的微生物，不仅能够存在于污染的食品和食品工厂当中，而且在家居环境和几乎所有的环境中均能够分离得到［2］。为主动掌握阪崎肠杆菌的污染状况及分布趋势，本研究展开了对10类食品的摸底调查。该10类食品基本包括市面上销售的主要食品，有国产的也有进口的，有本地的也有外地的，有生的也有熟的，有国家级省级名牌，也有本地区名优食品等。对公共卫生领域中的监管和预警，对推进社会的科学发展，弘扬本土的饮食文化，起着积极的作用。
1 材料与方法
1.1 样品采集 兼顾到城区和乡镇、东南西北各方位，2010年7月~2010年12月样品采抽于大型商场、超市、农贸市场、酒店、餐馆、小吃店、快餐店、饼铺、士多店等共20个区镇328家销售的10类食品，分别有奶类、糖饼类、面包蛋糕、熟肉制品、饮用水、调味品、方便面、生肉、冰淇淋、巧克力坚果等共850份。原则上要求同类食品品牌不重复，优先抽取本地产品、具地方特色产品和消费量较大的产品，包装完整、保质期内。每份样品抽双份，一份为送检样，一份为留样。
1.2 主要培养基与试剂 BPW、mLST-Vm 、DFI、TSA购于北京陆桥；阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测试剂盒购于深圳太太基因工程有限公司；氧化酶试剂购于广州千江有限公司；G阴性板、ID肉汤购于美国BD，均在有效期内使用。
1.3 标准菌株 阪崎肠杆菌ATCC51329购于广东环凯微生物科技有限公司。
1.4 检测仪器 美国BD PHOENIX 100全自动细菌鉴定药敏系统；美国OPTICON2实时荧光定量检测仪；日本奥林巴斯BX51T-32H01系统显微镜。
1.5 方法 国标法、实时荧光PCR法同步进行，标准菌株作对照。
1.5.1 国标法 样品处理按GB4789.40-2010《食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》进行。mLST-Vm肉汤培养液增菌后，挑取1环划线于DFI显色平板，（36±1）℃培养（24±2） h。挑取1～5个呈圆形、蓝绿色，直径为1～2mm的可疑菌落作革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定(选用美国BD PHOENIX 100全自动细菌鉴定药敏系统)，接种TSA平板观察黄色色素，综合菌落形态和生化特征报告检测结果。定性检出阪崎肠杆菌后作MPN值计数。
1.5.2 实时荧光PCR法 样品处理按国标法进行。接mLST-Vm肉汤培养液增菌后，取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000rpm离心5min，弃上清液。加入50μl核酸溶解液，混匀后沸水浴5min，13000rpm离心5min，取上清液待检。然后按试剂盒说明书操作，根据检测样品Ct值报告阳性或阴性结果。
2 结果
2.1 （1）奶类100份包括液态奶、奶饮品60份和奶粉、婴幼儿米粉40份，其中有1份奶饮品和1份婴幼儿米粉检出阪崎肠杆菌。（2）糖饼类175份包括饼干酥角等110份、杏仁饼30份、糖果35份，依次检出阪崎肠杆菌株数为1、12、1。（3）巧克力坚果80份包括巧克力50份、坚果30份，依次检出阪崎肠杆菌株数为2、9。（4）方便面包括杯面、袋装面40份，检出阪崎肠杆菌2株。（5）冰淇淋30份（因抽检时间安排在冬天，大部分商品已退出市场，抽检件数稍小）检出阪崎肠杆菌6株。（6）饮用水83份包括500ml等小瓶装和18.9 L大桶装，实时荧光PCR法2份阳性。（7）152份熟肉制品分5类：叉烧排骨、卤肉、烧肉、烧鸡鸭鹅、油鸡切鸡等检出阪崎肠杆菌14株。（8）面包糕点类含速冻包子馒头和即食糕点等80份，检出阪崎肠杆菌5株。
2.2 生肉和调味品采用国标法、实时荧光PCR法均未检出阪崎肠杆菌。
3 讨论
3.1 阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii)是人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性无芽胞杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，一直被称为黄色阴沟杆菌（yellow pigmented enterobacter cloacae）。而阴沟杆菌则是食品卫生质量指标中大肠菌群的指示菌之一，阪崎肠杆菌的存在直接影响大肠菌群MPN值，本研究曾在检出的54株阪崎肠杆菌中随机抽取20株作大肠菌群测定，均显示阳性结果。
3.2 阪崎肠杆菌对营养的要求不高，耐热耐寒耐高温，对清洁剂杀菌剂有较强的抵抗力，是一种普遍存在的微生物［3，4］。本研究数据显示，10类食品当中有7类检出阪崎肠杆菌，可见阪崎肠杆菌存在的广泛性。其中冰淇淋、坚果、杏仁饼（地方特色食品）和熟肉检出率较高，染菌量也较浓（见表2，表3），可能与加工制作过程或工艺流程有关，存在一定的致病风险，应引起警惕。
未检出阪崎肠杆菌的3类食品分别是饮用水、调味品、生肉。（1）直接饮用水中存在该菌的数量甚少，83份水样品国标法均未检出，只有实时荧光PCR法2份阳性；（2）50份调味品包括酱油、醋、青芥辣、辣酱、复合调味料，具有酸、甜、苦、辣、咸等各种味道的特点，还含有各式各样添加剂、防腐剂，酸碱度不同，不利于阪崎肠杆菌的生长；（3）60份生肉包括禽肉、畜肉、鱼虾贝类3种，在分离培养过程中发现有较多的干扰菌，分别检出普通/彭氏变形杆菌16株、奇异变形杆菌1株、大肠埃希氏菌1株，共17株。这些干扰菌在分离平板上呈优势生长，是否抑制了阪崎肠杆菌，有待进一步探讨。
3.3 阪崎肠杆菌虽然广泛存在于自然界，但食品中的染菌量一般不高。本研究定量结果发现，染菌量在30 MPN/100g(ml)浓度范围以下的占72.3%（39/54），其中有7份样品检验结果为＜0.3 MPN/100g(ml) (曾作重复试验)，不同部位取材、分布不均，或污染量甚微所致。也就是说大多数食品中阪崎肠杆菌的存在量较少，分布又非常不均匀，检验时必须采用大量、均匀的样品接种，才有可能覆盖到该菌的污染。可见阪崎肠杆菌国标法MPN/值计数所规定的样品用量333g(ml)，较其他致病菌25g(ml) 用量高的合理性。
3.4 两种方法对比 实时荧光PCR法检测时间短，灵敏度高，是初筛的好方法，而国标法则是报告结果的依据。本研究所采用实时荧光PCR法试剂盒的灵敏度为102-103copies/ml，国标法定性检出限是每100g（ml）样品检出或未检出阪崎肠杆菌。检测结果是PCR法阳性率为7.4%（63/850），国标法检出率为6.4 %（54/850）。即850份样品中有841份国标法和实时荧光PCR法检测结果一致，9份不同。日常工作中，也时而遇到实时荧光PCR法阳性而国标法未检出的事例，如沙门氏菌、副溶血性弧菌、出血性大肠埃希氏菌O157等的检验都有所见。当国标法未检出而PCR法阳性时应反复分离培养，以防漏检。总之两种方法同步使用可提高检测结果的可靠性。
3.5 方法探讨 （1）阪崎肠杆菌检验国标法全过程需要6d，增菌培养3d后如直接采用DFI平板上的纯菌落（或再分纯1d）作生化鉴定，可缩短1~2d检测时间。也可同时接种TSA平板观察黄色色素，即生化鉴定和色素观察同时进行，两不误。（2）850份样品按国标法进行分离培养，在操作过程中发现： DFI显色平板上的阪崎肠杆菌菌落与多种干扰菌的菌落较为相似，均呈圆形、蓝绿色、大小1～3mm。分别是普通/彭氏变形杆菌24株、肺炎克雷伯氏菌5株、非脱羧勒克氏菌3株、成团肠杆菌2株、奇异变形杆菌1株、大肠埃希氏菌1株、伤口埃希氏菌1株、日沟维肠杆菌1株、塞氏枸橼酸杆菌1株，共39株，详细见表1。通过划线于TSA平板、生化鉴定、PCR法可以区分。（3）检验全过程关键控制点是培养温度，分别有3种：36℃、44℃、25℃，须严格把关，否则直接影响检验结果。点滴体会仅供参考，希望能起抛砖引玉的作用。
本研究在检出的54株阪崎肠杆菌菌株中随机抽取16株（约1/3量）上送省级主管部门确证，结果反馈准确率达100%。
参考文献
［1］鲁曦，师宝忠，王彬等.LAMP法检测乳粉中的阪崎肠杆菌.现代食品科技，2010，26(5)：540-543.
［2］Leclercq A，Wanegue C，Baylac P，et al.Comparison of Fecal Coliform Agar and Violet Red Bile Lactose Agar for Fecal Coliform Enumeration in Foods.Applied and Environmental Microbiology，2002，68(4)：1631-1638.
［3］张雪梅，孙鑫贵，卢阳等.阪崎肠杆菌的研究进展.中国乳品工业，2008,36（3）：42-46.
［4］梁鹰，王红戟.阪崎肠杆菌研究进展.中国微生态学杂志，2008,20（4）：418-420.
（收稿日期：2011-04-06）
（本文编辑：梅宏伟）