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【摘 要】乳酸菌和肠杆菌在传统食品的发酵中容易引起食品的腐败，本文主要研究从传统胀罐酱油中，经过分离、筛选到了3株疑似腐败菌，并对其生物活动进行形态、生理生化特性研究及DNA序列分析，最终分别鉴定为产气肠杆菌、从酱酷中分离到的尿肠球菌和从胀罐酱油中分离到马里乳杆菌。研究表明，产气肠杆菌具有极强产气性、而马里乳杆菌也具微弱产气性；将这三株菌接种到成品酱油中发现，均能微弱改变酱油pH值；同时这三株菌均对温度、pH、盐度具有耐受性；产气肠杆菌和尿肠球菌为条件致病菌，对消费者存在潜在危害，同时本研究发现马里乳杆菌的存在会引起酱油胀气、降低pH，从而导致酱油腐败这三株菌的分离鉴定，对酱油的质量保证和食用安全性具有重要意义
【关键词】酱油；腐败菌；鉴定；乳酸菌；肠杆菌
引言
本课题主要针对通过了解腐败菌研究现状和现存问题后，从不同来源处取样，然后进行反复筛选培养，得到部分产酶较好的腐败菌生产菌，并且在此基础上筛选具有热稳定性腐败菌生产菌株，并进一步了解和掌握腐败菌生产菌的影响因素，例如培养温度，初始pH，培养时间等。以及筛选菌株产生的腐败菌的活性是否耐高温的研究。并对所选菌株根据培养特征、生理生化分析及16S rDNA序列同源性分析初步鉴定菌株，然后对热稳定性腐败菌进行分离纯化。以期为腐败菌的应用打下基础。本实验前期研究表明，所筛选的菌株具有产热稳定性腐败菌的特性，本论文研究的目的是筛选出产耐高温的腐败菌菌株并对其进行基础研究，同时通过对产酶条件优化提高酶活力，并将特殊的腐败菌纯化，为以后的工程应用奠定可靠的基础。
一、酱油的发酵过程
酱油是世界上受欢迎的调味品之一，其在中国有着悠久的历史。传统的中国酱油发酵主要包括四个步骤：
1、原材料的准备；2、酱酷即把米曲霉、酱油曲霉抱子和真霉混合发酵两天，这种发酵方式最初运用在日本清酒发酵剂中；3、与盐水混合发酵；4、酱汁的提取和混合。在这些过程中，酱酷的发酵阶段对其最后的品质是至关重要的，某些发酵过程（如乳酸和酒精发酵）对芳香成分的形成具有重要的作用。许多报道对酱油中存在的微生物群落有争议，包括参与酱酷发酵过程影响瓶装产品质量的乳酸菌。酸化和酵素作用过程伴随着乳酸菌的生长，对许多发酵食品的风味、质地、防腐剂的质量有着很大的影响。肠球菌是重要乳酸菌的组成部分，并在发酵食品的生产中发挥重要的作用。然而，屎肠球菌是典型的条件致病菌，能够引起菌血症、心内膜炎和其他传染性疾病。肠杆菌属是能够通过食物由动物传染人类的重要致病菌，已经引起了相关方面的重视。此外，在食品加工过程中它们可能会污染并降低食品价值。之前的相关研究已经阐述了乳酸菌属和肠杆菌属的有害性与酱油腐败有关。很少有人知道这些潜在的致腐败菌参与中国传统酱油的酿造。酱油腐败主要表现为胀罐（产气）和由于微生物导致的pH值改变，而这些性质又决定了食品的质量和安全。因此，本研究的目的是通过表型分析和分子生物学的方法确定疑似乳酸菌和肠杆菌是存在于酱油发酵过程中的。
二、酱油腐败菌的分离鉴定及特性研究
（一）、材料和方法。1、样品收集本研究所用的胀罐的和正常的瓶装酱油来源于中国西北部的山西省当地的一家工厂；所用的酱酷样品来源于中国南部广东省的某工厂，并且他们的瓶装酱油同样有胀罐现象。2、主要试剂和材料。限制性内切酶Hae III， Hinf I和Msp I； T4 DNA连接酶；DNA Marker； PCR片段纯化试剂盒和基因组提取试剂盒均为捷瑞公司提供；其它化学试剂均为分析纯3主要仪器设备。SUKUN双层小容量全温恒温培养摇床；eppendorf舒适型恒温混匀器；eppendorf梯度PCR仪；Tanon EPS 100核酸电泳仪；B io-Rad照胶成像仪
4、实验方法。（1）、菌株分离。取酱酷10.00 g或者瓶装酱油10.00 mL加到90.00mL 0.85% NaCI溶液中，150r/min下摇床混匀。再用10倍连续稀释法进行梯度稀释。取100.00uL稀释液涂板于LB培养基、添加5%葡萄糖的LB培养基和添加5%葡萄糖MRS培养基。LB和MRS平板均在370C恒温培养箱培养1}3天。同时对胀罐酱油进行菌落计数。纯菌落划线后保存在30%甘油的MRS培养基。（2）、表型特征分析。用光学显微镜观察其革兰氏染色、形态和运动性。根据文献方法[8]对其过氧化氢酶活性和硝酸盐还原性能进行了测试。D一葡萄糖和乳糖产气实验通过倒扣在MRS肉汤中的杜氏管进行检测。糖发酵实验参照之前所述。（3）、ERIC-PCR基因分型和PCR-RFLP菌株鉴定。通过ERIC-PCR技术对分离菌株的基因型的多样性进行分析。采用细菌基因组提取试剂盒（捷瑞GK1071）提取总基因组。ERIC-PCR技术所用的上游引物ERIC-1R（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3）和下游引ERIC2C5'AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）。ERIC-PCR总反应体系为25匹，包括预混酶Ex Taq DNA聚合酶12.5匹、上下游引物各1匹C20哪）、模板DNA1匹，补水至25匹体系。设定反应条件为940C预变性5min}30个循环（940C变性30s，500C退火30s，720C延伸4min后，720C延伸10min}160C保存。扩增片段在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测后，用凝胶成像系统对其成像。扩增片段大小用Quantity One 4.4.0分析软件进行定量。PCR-RFLP技术对分离株16S rRNA基因进行分析以获得其基因型特征。用先前描述的方法对16SrRNA基因进行扩增。根据操作说明，扩增片段分别用Hae III， Hinf I和Msp I进行酶切消化。酶切片段通过 3.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统对其成像。酶切片段大小用Quantity One 4.4.0分析软件进行定量（4）、16SrRNA %}}J序和species-specific PCR。将分离的单菌落接种于MRS培养基中培养1-3 d生长至稳定期。采用细菌基因组提取试剂盒（捷瑞GK1071）提取总基因组。16S rRNA通用引物为：上游引物27F CS'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG -3'）下游引物1492RC5'-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3'） 。扩增的16S rRNA片段插入质粒pMD 18-T后，在英俊公司测序。测得的16S rRNA基因序列运用NCBI数据库中的BLAST工具搜索与其具有较高同源性的细菌，进行比对。用MEGA 4.0 UPGMA法构建系统发育树。同时采用了species-specific PCR鉴定肠球菌。（5）、分离株的生长情况和酸碱活性测定。分离株以1%的接种量接种至MRS培养基中，30或37度培养。以3%CV/V）接种量接种至含5%（mlV）的葡糖糖酱油成品中，300C培养。不同时间点取样，测定其生长曲线和酸碱活性。用pH计测定pH值来评估菌株酸碱活性。1.4.6温度、pH值和耐盐性研究分别检测分离菌在不同的温度（4，15，45，500C），不同的初始pH值（C3，4，5，6）及不同盐浓度（CS%，10%，15%，18%CmlV））下的生长情况。对分离株的热稳定性进行检测，预培养的分离株悬浮液在65度。温浴1min和5min）30度为阳性对照，计算存活率。（二）、结果和讨论。本研究中，从酱酷中分离出两株不同的细菌命名为菌株A和菌株B。菌株A为革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性、能动、硝酸盐还原阳性杆菌，具有利用葡萄糖和乳糖产气的能力。鉴于其革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原阴性和非能动的特征，菌株B被认为是乳酸菌。为进一步鉴定分离株，进行糖发酵实验。根据革兰氏手册，菌株A和B分属于肠杆菌属和肠球菌属（或者链球菌属）。菌株C在MRS琼脂培养基上300C培养3d后只在胀罐的酱油产品中检出，为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、硝酸盐还原阴性、杆状、微产气能力，属于乳杆菌，其在胀罐酱油中含量大约为3.60LogCFU/mL（数据未显示）。对三株菌进行ERIC-PCR和PCR-RFLP分型同种。采用16SrRNA测序法进一步鉴定这三株菌。根据测序结果及进化树分析表明，菌株A和产气肠杆菌有99%的同源性，菌株B和屎肠球菌（或粪肠球菌）有99%的同源性，菌株C和马里乳杆菌有99%的同源性。为进一步区分菌株B，分采用屎肠球菌和粪肠球菌特异性引物进行PCR。根据文献报道，用屎肠球菌特性引物可以得到约550byPCR产物，而粪肠球菌特异性则未扩增出目的片段，
结语
本研究首次从酱酷中分离筛选出条件致病菌产气肠杆菌和屎肠球菌，并从胀罐酱油中分离筛选出马里乳杆菌。产气实验证实，产气肠杆菌具强产气性，马里乳杆菌也具微弱产气性；经酸碱活性实验证实，产气肠杆菌具有强产碱性，同时屎肠球菌和马里乳杆菌有微弱的产酸活性，这些特性将导致酱油腐败，影响酱油成品的质量和安全性。同时对这三株菌温度、pH及其耐盐性等特性研究，为酱油成品中彻底灭菌提供一定的依据。而酱油腐败有众多因素掺杂其中，有待于进一步研究。
参考文献
[1]李增利，唐平.Nisin在酱油保鲜中的应用研究[J].食品科学，2003，01
[2]李增利，唐平.生物防腐剂用于酱油保鲜的研究[J].食品科技，2003，03
[3]邵文尧，陈旭，刘正贵，何宁，王海涛，李清彪.中草药用于酱油防腐初步研究[J].精细化工，2010，03
[4]林崇昌，邓丽芳，司徒小玉，邓秀燕，司徒荣阮，王雪梅，吴灿斌.防腐剂联合使用对酱油防腐效果的影响[J].中国卫生检验杂志，2011，04
[5]蔡俊.壳低聚糖在酿造酱油中的抑菌效果研究[J].中国酿造，2005，06：13-15.
【关键词】酱油；腐败菌；鉴定；乳酸菌；肠杆菌
引言
本课题主要针对通过了解腐败菌研究现状和现存问题后，从不同来源处取样，然后进行反复筛选培养，得到部分产酶较好的腐败菌生产菌，并且在此基础上筛选具有热稳定性腐败菌生产菌株，并进一步了解和掌握腐败菌生产菌的影响因素，例如培养温度，初始pH，培养时间等。以及筛选菌株产生的腐败菌的活性是否耐高温的研究。并对所选菌株根据培养特征、生理生化分析及16S rDNA序列同源性分析初步鉴定菌株，然后对热稳定性腐败菌进行分离纯化。以期为腐败菌的应用打下基础。本实验前期研究表明，所筛选的菌株具有产热稳定性腐败菌的特性，本论文研究的目的是筛选出产耐高温的腐败菌菌株并对其进行基础研究，同时通过对产酶条件优化提高酶活力，并将特殊的腐败菌纯化，为以后的工程应用奠定可靠的基础。
一、酱油的发酵过程
酱油是世界上受欢迎的调味品之一，其在中国有着悠久的历史。传统的中国酱油发酵主要包括四个步骤：
1、原材料的准备；2、酱酷即把米曲霉、酱油曲霉抱子和真霉混合发酵两天，这种发酵方式最初运用在日本清酒发酵剂中；3、与盐水混合发酵；4、酱汁的提取和混合。在这些过程中，酱酷的发酵阶段对其最后的品质是至关重要的，某些发酵过程（如乳酸和酒精发酵）对芳香成分的形成具有重要的作用。许多报道对酱油中存在的微生物群落有争议，包括参与酱酷发酵过程影响瓶装产品质量的乳酸菌。酸化和酵素作用过程伴随着乳酸菌的生长，对许多发酵食品的风味、质地、防腐剂的质量有着很大的影响。肠球菌是重要乳酸菌的组成部分，并在发酵食品的生产中发挥重要的作用。然而，屎肠球菌是典型的条件致病菌，能够引起菌血症、心内膜炎和其他传染性疾病。肠杆菌属是能够通过食物由动物传染人类的重要致病菌，已经引起了相关方面的重视。此外，在食品加工过程中它们可能会污染并降低食品价值。之前的相关研究已经阐述了乳酸菌属和肠杆菌属的有害性与酱油腐败有关。很少有人知道这些潜在的致腐败菌参与中国传统酱油的酿造。酱油腐败主要表现为胀罐（产气）和由于微生物导致的pH值改变，而这些性质又决定了食品的质量和安全。因此，本研究的目的是通过表型分析和分子生物学的方法确定疑似乳酸菌和肠杆菌是存在于酱油发酵过程中的。
二、酱油腐败菌的分离鉴定及特性研究
（一）、材料和方法。1、样品收集本研究所用的胀罐的和正常的瓶装酱油来源于中国西北部的山西省当地的一家工厂；所用的酱酷样品来源于中国南部广东省的某工厂，并且他们的瓶装酱油同样有胀罐现象。2、主要试剂和材料。限制性内切酶Hae III， Hinf I和Msp I； T4 DNA连接酶；DNA Marker； PCR片段纯化试剂盒和基因组提取试剂盒均为捷瑞公司提供；其它化学试剂均为分析纯3主要仪器设备。SUKUN双层小容量全温恒温培养摇床；eppendorf舒适型恒温混匀器；eppendorf梯度PCR仪；Tanon EPS 100核酸电泳仪；B io-Rad照胶成像仪
4、实验方法。（1）、菌株分离。取酱酷10.00 g或者瓶装酱油10.00 mL加到90.00mL 0.85% NaCI溶液中，150r/min下摇床混匀。再用10倍连续稀释法进行梯度稀释。取100.00uL稀释液涂板于LB培养基、添加5%葡萄糖的LB培养基和添加5%葡萄糖MRS培养基。LB和MRS平板均在370C恒温培养箱培养1}3天。同时对胀罐酱油进行菌落计数。纯菌落划线后保存在30%甘油的MRS培养基。（2）、表型特征分析。用光学显微镜观察其革兰氏染色、形态和运动性。根据文献方法[8]对其过氧化氢酶活性和硝酸盐还原性能进行了测试。D一葡萄糖和乳糖产气实验通过倒扣在MRS肉汤中的杜氏管进行检测。糖发酵实验参照之前所述。（3）、ERIC-PCR基因分型和PCR-RFLP菌株鉴定。通过ERIC-PCR技术对分离菌株的基因型的多样性进行分析。采用细菌基因组提取试剂盒（捷瑞GK1071）提取总基因组。ERIC-PCR技术所用的上游引物ERIC-1R（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3）和下游引ERIC2C5'AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）。ERIC-PCR总反应体系为25匹，包括预混酶Ex Taq DNA聚合酶12.5匹、上下游引物各1匹C20哪）、模板DNA1匹，补水至25匹体系。设定反应条件为940C预变性5min}30个循环（940C变性30s，500C退火30s，720C延伸4min后，720C延伸10min}160C保存。扩增片段在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测后，用凝胶成像系统对其成像。扩增片段大小用Quantity One 4.4.0分析软件进行定量。PCR-RFLP技术对分离株16S rRNA基因进行分析以获得其基因型特征。用先前描述的方法对16SrRNA基因进行扩增。根据操作说明，扩增片段分别用Hae III， Hinf I和Msp I进行酶切消化。酶切片段通过 3.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统对其成像。酶切片段大小用Quantity One 4.4.0分析软件进行定量（4）、16SrRNA %}}J序和species-specific PCR。将分离的单菌落接种于MRS培养基中培养1-3 d生长至稳定期。采用细菌基因组提取试剂盒（捷瑞GK1071）提取总基因组。16S rRNA通用引物为：上游引物27F CS'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG -3'）下游引物1492RC5'-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3'） 。扩增的16S rRNA片段插入质粒pMD 18-T后，在英俊公司测序。测得的16S rRNA基因序列运用NCBI数据库中的BLAST工具搜索与其具有较高同源性的细菌，进行比对。用MEGA 4.0 UPGMA法构建系统发育树。同时采用了species-specific PCR鉴定肠球菌。（5）、分离株的生长情况和酸碱活性测定。分离株以1%的接种量接种至MRS培养基中，30或37度培养。以3%CV/V）接种量接种至含5%（mlV）的葡糖糖酱油成品中，300C培养。不同时间点取样，测定其生长曲线和酸碱活性。用pH计测定pH值来评估菌株酸碱活性。1.4.6温度、pH值和耐盐性研究分别检测分离菌在不同的温度（4，15，45，500C），不同的初始pH值（C3，4，5，6）及不同盐浓度（CS%，10%，15%，18%CmlV））下的生长情况。对分离株的热稳定性进行检测，预培养的分离株悬浮液在65度。温浴1min和5min）30度为阳性对照，计算存活率。（二）、结果和讨论。本研究中，从酱酷中分离出两株不同的细菌命名为菌株A和菌株B。菌株A为革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性、能动、硝酸盐还原阳性杆菌，具有利用葡萄糖和乳糖产气的能力。鉴于其革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，硝酸盐还原阴性和非能动的特征，菌株B被认为是乳酸菌。为进一步鉴定分离株，进行糖发酵实验。根据革兰氏手册，菌株A和B分属于肠杆菌属和肠球菌属（或者链球菌属）。菌株C在MRS琼脂培养基上300C培养3d后只在胀罐的酱油产品中检出，为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、硝酸盐还原阴性、杆状、微产气能力，属于乳杆菌，其在胀罐酱油中含量大约为3.60LogCFU/mL（数据未显示）。对三株菌进行ERIC-PCR和PCR-RFLP分型同种。采用16SrRNA测序法进一步鉴定这三株菌。根据测序结果及进化树分析表明，菌株A和产气肠杆菌有99%的同源性，菌株B和屎肠球菌（或粪肠球菌）有99%的同源性，菌株C和马里乳杆菌有99%的同源性。为进一步区分菌株B，分采用屎肠球菌和粪肠球菌特异性引物进行PCR。根据文献报道，用屎肠球菌特性引物可以得到约550byPCR产物，而粪肠球菌特异性则未扩增出目的片段，
结语
本研究首次从酱酷中分离筛选出条件致病菌产气肠杆菌和屎肠球菌，并从胀罐酱油中分离筛选出马里乳杆菌。产气实验证实，产气肠杆菌具强产气性，马里乳杆菌也具微弱产气性；经酸碱活性实验证实，产气肠杆菌具有强产碱性，同时屎肠球菌和马里乳杆菌有微弱的产酸活性，这些特性将导致酱油腐败，影响酱油成品的质量和安全性。同时对这三株菌温度、pH及其耐盐性等特性研究，为酱油成品中彻底灭菌提供一定的依据。而酱油腐败有众多因素掺杂其中，有待于进一步研究。
参考文献
[1]李增利，唐平.Nisin在酱油保鲜中的应用研究[J].食品科学，2003，01
[2]李增利，唐平.生物防腐剂用于酱油保鲜的研究[J].食品科技，2003，03
[3]邵文尧，陈旭，刘正贵，何宁，王海涛，李清彪.中草药用于酱油防腐初步研究[J].精细化工，2010，03
[4]林崇昌，邓丽芳，司徒小玉，邓秀燕，司徒荣阮，王雪梅，吴灿斌.防腐剂联合使用对酱油防腐效果的影响[J].中国卫生检验杂志，2011，04
[5]蔡俊.壳低聚糖在酿造酱油中的抑菌效果研究[J].中国酿造，2005，06：13-15.