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摘要[目的]利用ISSR分子标记构建盾叶薯蓣品种鉴定的DNA指纹图谱，为盾叶薯蓣药材鉴定和良种选育提供技术支持。[方法]筛选ISSR引物，对10个盾叶薯蓣品种进行PCR扩增和电泳检测，统计条带并进行遗传多样性分析、聚类分析等；选择核心引物，建立DNA指纹图谱鉴定体系。[结果]从50条ISSR引物中筛选出9条，对10个品种扩增共得到86条谱带，多态性条带72条，多态性条带比率为83.72%；选出3条ISSR核心引物建立了10个薯蓣品种的ISSR指纹鉴定图谱。[结论]盾叶薯蓣品种遗传多样性丰富；3条核心引物所构建的植物图谱中，每个品种均有各自特異的共有谱带、特有谱带、缺失谱带，这些谱带的组合可用于盾叶薯蓣品种鉴定。
关键词盾叶薯蓣；ISSR；品种鉴定；ISSR指纹图谱
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-024-03
Abstract[Objective] With the aim to identify Dioscorea zingiberensis varieties， ISSR molecular markers was used to get its DNA fingerprint. [Method] ISSR primers were screened out， the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 10 D. zingiberensis. varieties， genetic diversity analyses and cluster analyses were performed， and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system. [Result] 9 primers with clear band and high polymorphism were selected from 50. A total of 86 bands were amplified from 10 D. zingiberensis varieties， 72 bands among them were polymorphic， the percentage of polymorphism band （PPB） was 83.72%. Three core primers were select out to set up fingerprint of 10 D. zingiberensis Varieties. [Conclusion] The genetic diversity of D. zingiberens varieties was abundant. Each of 10 variety has its universal bands and specific bands， these unique bands can be used in the identification of the D. zingiberensis varieties.
Key wordsDioscorea zingiberensis C. H. Wright； ISSR； Variety identification； ISSR fingerprint
盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），又名黄姜，为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生藤本植物[1]。其块状根中所含的薯蓣皂苷元是合成避孕药、甾体激素类药物的重要起始原料，也是生产皮质激素、性激素和蛋白同化激素类药物的重要原料，被称之为激素之母[2-3]。因此，盾叶薯蓣是一种重要的药用植物资源。
我国盾叶薯蓣资源丰富，主要分布于长江流域各省区，在陕西、河南、湖北、四川和重庆等地作为经济作物广泛栽培[4]。然而，不同地域的盾叶薯蓣种质因受当地气候、土壤等因素影响，其薯蓣皂苷的含量有明显差异。为了筛选出优良的盾叶薯蓣品种以利于种植和薯蓣皂素的生产与加工，有必要对不同产地的盾叶薯蓣种质进行精准的鉴定。
简单重复序列间隔区（intersimple sequence repeat，ISSR）是1994年由加拿大蒙特利尔大学[5]发展起来的一种基于微卫星序列的分子标记技术。该标记以显性或共显性的孟德尔方式遗传，事先不需知道靶序列，由于具有更长的引物序列和较高的退火温度，因此产生可靠性高、重复性好的扩增条带，而且模板需要量少，多态性丰富，试验操作相对简单，无需试剂盒，结果记录方便[6-7]。因此，ISSR被认为是研究种群遗传多样性一种非常有效的分子标记手段，已被广泛应用于品种和种质鉴定、遗传图谱构建、物种和种群的亲缘关系分析等方面的研究[8-9]。
笔者以陕西省南部秦岭巴山地区的盾叶薯蓣种质为材料，应用ISSR分子标记引物检测各盾叶薯蓣种质资源的DNA多态性，构建适合盾叶薯蓣种质资源鉴定的DNA指纹图谱，以期为该地区盾叶薯蓣资源的评价筛选和分子鉴定提供重要的理论和技术支撑，为盾叶薯蓣产业的持续发展奠定良好的基础。
1材料与方法
1.1材料
10个盾叶薯蓣种质材料采自陕西南部的秦岭、巴山地区（表1）。野外采集植物幼嫩叶片，放入密封袋内用硅胶干燥，带回实验室后置于-20 ℃的冰箱内保存备用。
1.2方法
1.2.1DNA的提取与检测。
采用改良的2×CTAB法提取植物的基因组DNA[10]。应用微量核酸蛋白检测仪检测其纯度。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整度。 1.2.2引物筛选与PCR扩增。
选用2个纯度高、完整性好盾叶薯蓣DNA为模板，对50条ISSR引物（UBC801～UBC850，由不列颠哥伦比亚大学设计，上海生工合成）进行PCR扩增，以筛选出条带稳定的ISSR引物。PCR反应体系20 μl，包括50 ng模板DNA，1.0 μmol/L引物，1 U Taq聚合酶，0.4 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2+。PCR反应程序：94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，最后在4 ℃保存。PCR产物用2%的琼脂凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1.0 TBE，电压为4 V/cm。
从上述50条ISSR引物中筛选出9条扩增条带稳定清晰的ISSR引物，并对这9条引物的温度进行梯度试验，以确定其最适退火温度。然后，在最适退火温度下用上述9条ISSR引物对10个薯蓣种质资源样本进行PCR扩增和琼脂糖电泳检测。
1.3数据处理与分析
ISSR以扩增条带在相对迁移位置上的“有（显性）”或“无（隐性）”，分别赋以“1”或“0”，获得0、1二元数据矩阵。利用POPGENE Version 1.32软件分析盾叶薯蓣品种的多态位点比率（PPL），估算各种质间的Nei’s遗传距离（GD），并用MEGA5软件基于Nei’s遗传距离矩阵，采用UPGMA法进行聚类分析构建这10个盾叶薯蓣种质资源的聚类图。统计各引物的多态性位点比例；选择多态性最高的3条引物构建能用于鉴定这10个种质资源的DNA鉴定体系。
2结果与分析
2.1薯蓣种质资源DNA的提取效果及ISSR引物筛选
用改良的2×CTAB法提取盾叶薯蓣各种质资源基因组DNA的纯度良好，分光光度检验所得OD260/280为1.77±0.18；提取的DNA完整度也很好，琼脂糖电泳检测出的大片段明显（图1），能用于ISSR引物的PCR扩增。
2.210个盾叶薯蓣品种的遗传多样性与遗传关系
用筛选出来的9条ISSR引物，对10份盾叶薯蓣种质样本进行PCR扩增和琼脂糖电泳检测。引物UBC825对10个样品的扩增效果见图2。经条带统计和遗传多样性分析，结果表明，9条引物共扩增出86条清晰可辨的条带，其中多态性位点72条，多态性条带比例为83.72%。基于遗传相似度进行聚类分析得到10个品种的UPGMA聚类树（图3）。结果表明，10个盾叶薯蓣品种聚为3个大支，其中采自巴山西段的3个品种（NQ，NZ，CG）地理位置较近，聚为一支；采自巴山中段的2个品种（XX和ZB）聚在一起成为一支；其他几个品种均采自秦岭地区，聚成另一支。从各品种的聚类关系可以看出，地理距离较近的品种首先聚在一起，表现出较近的亲缘关系。
2.310个盾叶薯蓣的DNA指纹鉴定图谱
筛选出9条ISSR引物对10个盾叶薯蓣品种进行检测分析，发现其中的3条引物UBC811、UBC8189和UBC825扩增效果好，不但条带稳定清晰，而且多态性高。这3条引物共扩增出30条谱带，每个品种在这3条引物上都有特征条带，这30条条带的组合可有效区分所有薯蓣DNA样品，可以作为DNA鉴定指纹图谱用于这10个品种的鉴定（表1）。
3讨论
由于选用品种以及生长环境的不同，不同区域盾叶薯蓣品种的质量存在显著差异。盾叶薯蓣品种在形态特征上极为相似，农业生产上还有误栽培薯蓣属其他植物充作盾叶薯蓣的情况，因此栽培品种混乱，不利于产业的长期发展。传统的形态学鉴定方法主要是根据地下茎的性状、种子在蒴果上的着生位置等性状来区别盾叶薯蓣和薯蓣属其他植物，而种内品种间的形态差别更为细微，因此基于传统方法对盾叶薯蓣品种进行鉴定难度非常大。一个好的指纹图谱应该具有简单、高效、准确等特点。利用分子标记技术进行品种鉴定可以不受环境影响，从遗传物质水平上直接反映品种间的差异，为品种鉴定提供了操作性强、准确性高的方法[7]。
该研究从50对ISSR引物中筛选出10条（表2）条带稳定、多态性高的引物对10个盾叶薯蓣品种进行了遗传分析，结果表明，盾叶薯蓣品种遗传变异丰富（PPB=0.837 2）。薯蕷为单子叶植物较为进化的类群，该研究所用的10个品种均为当地野生品种驯化而来，虽然有一段时间的栽培历史，仍然保持较高遗传多样性，未发现种质退化。另外，该研究结果表明10个品种大致聚为三大支，地理距离较近的品种首先聚在一起。这说明该物种的遗传分化与其地理隔离有关，地理隔离造成了基因流限制，进而造成不同群体的遗传漂变和遗传分化，这是其现今遗传结构的重要形成原因。
ISSR分子标记技术以显性或共显性的孟德尔方式遗
传，由于较高的退火温度和更长的引物序列，可以产生较可靠和重复性好的扩增带[6]。该研究筛选出来的9条ISSR引物共扩增出86条条带，其中72条为多态性条带，且条带的稳定性、可重复性高，这些ISSR引物不仅能用于盾叶薯蓣品种的鉴定，如有必要亦可用于该物种的群体遗传分析。
为了简单快捷地将不同盾叶薯蓣品种分开，从这10条引物中选出3条扩增稳定、重复性好、条带清楚、个体间差异大的引物（USB811、USB818和USB825）作为核心引物建立了这10个品种的鉴定图谱。这3条引物所扩增的30个条带中，每个品种均有各自特异的共有谱带、特有谱带、缺失谱带（表1），经多次PCR扩增和电泳检测验证，可用于盾叶薯蓣品种的DNA指纹鉴定。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：250-251.
[2] 丁志遵，唐世蓉，秦慧贞，等.甾体激素药源植物[M].北京：科学出版社，1983.
[3] 国家中医药管理局《中华本草》编辑委员会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1998.
[4] 任建伟，白云，郭秋月，等.盾叶薯蓣培养细胞的生长及薯蓣皂甙元产生的变化规律[J].中草药，1994，25（2）： 93-94.
[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（ISSR）anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20：176-183.
[6] 邹喻苹，葛颂，王晓东，等.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京：科学出版社，2001.
[7] 汪小全，邹喻苹，张大明，等.RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题[J].植物学报，1996，38（12）：954-962.
[8] 刘本英，孙雪梅，李友勇，等.20个云南无性系茶树良种的DNA指纹图谱构建[J].热带作物学报，2011，32（4）：720-727.
[9] 朱岩芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J].种子，2010，29（2）：1-2.
[10] 吴凯旋，屈亚娟，杨培君，等.独尾草DNA提取方法优化及ISSR反应体系的建立[J].陕西农业科学，2012（6）：111-115.
关键词盾叶薯蓣；ISSR；品种鉴定；ISSR指纹图谱
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-024-03
Abstract[Objective] With the aim to identify Dioscorea zingiberensis varieties， ISSR molecular markers was used to get its DNA fingerprint. [Method] ISSR primers were screened out， the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 10 D. zingiberensis. varieties， genetic diversity analyses and cluster analyses were performed， and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system. [Result] 9 primers with clear band and high polymorphism were selected from 50. A total of 86 bands were amplified from 10 D. zingiberensis varieties， 72 bands among them were polymorphic， the percentage of polymorphism band （PPB） was 83.72%. Three core primers were select out to set up fingerprint of 10 D. zingiberensis Varieties. [Conclusion] The genetic diversity of D. zingiberens varieties was abundant. Each of 10 variety has its universal bands and specific bands， these unique bands can be used in the identification of the D. zingiberensis varieties.
Key wordsDioscorea zingiberensis C. H. Wright； ISSR； Variety identification； ISSR fingerprint
盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright），又名黄姜，为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生藤本植物[1]。其块状根中所含的薯蓣皂苷元是合成避孕药、甾体激素类药物的重要起始原料，也是生产皮质激素、性激素和蛋白同化激素类药物的重要原料，被称之为激素之母[2-3]。因此，盾叶薯蓣是一种重要的药用植物资源。
我国盾叶薯蓣资源丰富，主要分布于长江流域各省区，在陕西、河南、湖北、四川和重庆等地作为经济作物广泛栽培[4]。然而，不同地域的盾叶薯蓣种质因受当地气候、土壤等因素影响，其薯蓣皂苷的含量有明显差异。为了筛选出优良的盾叶薯蓣品种以利于种植和薯蓣皂素的生产与加工，有必要对不同产地的盾叶薯蓣种质进行精准的鉴定。
简单重复序列间隔区（intersimple sequence repeat，ISSR）是1994年由加拿大蒙特利尔大学[5]发展起来的一种基于微卫星序列的分子标记技术。该标记以显性或共显性的孟德尔方式遗传，事先不需知道靶序列，由于具有更长的引物序列和较高的退火温度，因此产生可靠性高、重复性好的扩增条带，而且模板需要量少，多态性丰富，试验操作相对简单，无需试剂盒，结果记录方便[6-7]。因此，ISSR被认为是研究种群遗传多样性一种非常有效的分子标记手段，已被广泛应用于品种和种质鉴定、遗传图谱构建、物种和种群的亲缘关系分析等方面的研究[8-9]。
笔者以陕西省南部秦岭巴山地区的盾叶薯蓣种质为材料，应用ISSR分子标记引物检测各盾叶薯蓣种质资源的DNA多态性，构建适合盾叶薯蓣种质资源鉴定的DNA指纹图谱，以期为该地区盾叶薯蓣资源的评价筛选和分子鉴定提供重要的理论和技术支撑，为盾叶薯蓣产业的持续发展奠定良好的基础。
1材料与方法
1.1材料
10个盾叶薯蓣种质材料采自陕西南部的秦岭、巴山地区（表1）。野外采集植物幼嫩叶片，放入密封袋内用硅胶干燥，带回实验室后置于-20 ℃的冰箱内保存备用。
1.2方法
1.2.1DNA的提取与检测。
采用改良的2×CTAB法提取植物的基因组DNA[10]。应用微量核酸蛋白检测仪检测其纯度。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整度。 1.2.2引物筛选与PCR扩增。
选用2个纯度高、完整性好盾叶薯蓣DNA为模板，对50条ISSR引物（UBC801～UBC850，由不列颠哥伦比亚大学设计，上海生工合成）进行PCR扩增，以筛选出条带稳定的ISSR引物。PCR反应体系20 μl，包括50 ng模板DNA，1.0 μmol/L引物，1 U Taq聚合酶，0.4 mmol/L dNTP，2.5 mmol/L Mg2+。PCR反应程序：94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，最后在4 ℃保存。PCR产物用2%的琼脂凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1.0 TBE，电压为4 V/cm。
从上述50条ISSR引物中筛选出9条扩增条带稳定清晰的ISSR引物，并对这9条引物的温度进行梯度试验，以确定其最适退火温度。然后，在最适退火温度下用上述9条ISSR引物对10个薯蓣种质资源样本进行PCR扩增和琼脂糖电泳检测。
1.3数据处理与分析
ISSR以扩增条带在相对迁移位置上的“有（显性）”或“无（隐性）”，分别赋以“1”或“0”，获得0、1二元数据矩阵。利用POPGENE Version 1.32软件分析盾叶薯蓣品种的多态位点比率（PPL），估算各种质间的Nei’s遗传距离（GD），并用MEGA5软件基于Nei’s遗传距离矩阵，采用UPGMA法进行聚类分析构建这10个盾叶薯蓣种质资源的聚类图。统计各引物的多态性位点比例；选择多态性最高的3条引物构建能用于鉴定这10个种质资源的DNA鉴定体系。
2结果与分析
2.1薯蓣种质资源DNA的提取效果及ISSR引物筛选
用改良的2×CTAB法提取盾叶薯蓣各种质资源基因组DNA的纯度良好，分光光度检验所得OD260/280为1.77±0.18；提取的DNA完整度也很好，琼脂糖电泳检测出的大片段明显（图1），能用于ISSR引物的PCR扩增。
2.210个盾叶薯蓣品种的遗传多样性与遗传关系
用筛选出来的9条ISSR引物，对10份盾叶薯蓣种质样本进行PCR扩增和琼脂糖电泳检测。引物UBC825对10个样品的扩增效果见图2。经条带统计和遗传多样性分析，结果表明，9条引物共扩增出86条清晰可辨的条带，其中多态性位点72条，多态性条带比例为83.72%。基于遗传相似度进行聚类分析得到10个品种的UPGMA聚类树（图3）。结果表明，10个盾叶薯蓣品种聚为3个大支，其中采自巴山西段的3个品种（NQ，NZ，CG）地理位置较近，聚为一支；采自巴山中段的2个品种（XX和ZB）聚在一起成为一支；其他几个品种均采自秦岭地区，聚成另一支。从各品种的聚类关系可以看出，地理距离较近的品种首先聚在一起，表现出较近的亲缘关系。
2.310个盾叶薯蓣的DNA指纹鉴定图谱
筛选出9条ISSR引物对10个盾叶薯蓣品种进行检测分析，发现其中的3条引物UBC811、UBC8189和UBC825扩增效果好，不但条带稳定清晰，而且多态性高。这3条引物共扩增出30条谱带，每个品种在这3条引物上都有特征条带，这30条条带的组合可有效区分所有薯蓣DNA样品，可以作为DNA鉴定指纹图谱用于这10个品种的鉴定（表1）。
3讨论
由于选用品种以及生长环境的不同，不同区域盾叶薯蓣品种的质量存在显著差异。盾叶薯蓣品种在形态特征上极为相似，农业生产上还有误栽培薯蓣属其他植物充作盾叶薯蓣的情况，因此栽培品种混乱，不利于产业的长期发展。传统的形态学鉴定方法主要是根据地下茎的性状、种子在蒴果上的着生位置等性状来区别盾叶薯蓣和薯蓣属其他植物，而种内品种间的形态差别更为细微，因此基于传统方法对盾叶薯蓣品种进行鉴定难度非常大。一个好的指纹图谱应该具有简单、高效、准确等特点。利用分子标记技术进行品种鉴定可以不受环境影响，从遗传物质水平上直接反映品种间的差异，为品种鉴定提供了操作性强、准确性高的方法[7]。
该研究从50对ISSR引物中筛选出10条（表2）条带稳定、多态性高的引物对10个盾叶薯蓣品种进行了遗传分析，结果表明，盾叶薯蓣品种遗传变异丰富（PPB=0.837 2）。薯蕷为单子叶植物较为进化的类群，该研究所用的10个品种均为当地野生品种驯化而来，虽然有一段时间的栽培历史，仍然保持较高遗传多样性，未发现种质退化。另外，该研究结果表明10个品种大致聚为三大支，地理距离较近的品种首先聚在一起。这说明该物种的遗传分化与其地理隔离有关，地理隔离造成了基因流限制，进而造成不同群体的遗传漂变和遗传分化，这是其现今遗传结构的重要形成原因。
ISSR分子标记技术以显性或共显性的孟德尔方式遗
传，由于较高的退火温度和更长的引物序列，可以产生较可靠和重复性好的扩增带[6]。该研究筛选出来的9条ISSR引物共扩增出86条条带，其中72条为多态性条带，且条带的稳定性、可重复性高，这些ISSR引物不仅能用于盾叶薯蓣品种的鉴定，如有必要亦可用于该物种的群体遗传分析。
为了简单快捷地将不同盾叶薯蓣品种分开，从这10条引物中选出3条扩增稳定、重复性好、条带清楚、个体间差异大的引物（USB811、USB818和USB825）作为核心引物建立了这10个品种的鉴定图谱。这3条引物所扩增的30个条带中，每个品种均有各自特异的共有谱带、特有谱带、缺失谱带（表1），经多次PCR扩增和电泳检测验证，可用于盾叶薯蓣品种的DNA指纹鉴定。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：250-251.
[2] 丁志遵，唐世蓉，秦慧贞，等.甾体激素药源植物[M].北京：科学出版社，1983.
[3] 国家中医药管理局《中华本草》编辑委员会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1998.
[4] 任建伟，白云，郭秋月，等.盾叶薯蓣培养细胞的生长及薯蓣皂甙元产生的变化规律[J].中草药，1994，25（2）： 93-94.
[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（ISSR）anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20：176-183.
[6] 邹喻苹，葛颂，王晓东，等.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京：科学出版社，2001.
[7] 汪小全，邹喻苹，张大明，等.RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题[J].植物学报，1996，38（12）：954-962.
[8] 刘本英，孙雪梅，李友勇，等.20个云南无性系茶树良种的DNA指纹图谱构建[J].热带作物学报，2011，32（4）：720-727.
[9] 朱岩芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J].种子，2010，29（2）：1-2.
[10] 吴凯旋，屈亚娟，杨培君，等.独尾草DNA提取方法优化及ISSR反应体系的建立[J].陕西农业科学，2012（6）：111-115.