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【摘要】目的：观察传统成骨诱导培养液诱导人肾间质成纤维细胞发生成骨分化的效果，初步探讨肾乳头钙化斑形成的可能的细胞学机制。方法：实验分为2个组：传统成骨诱导液组和对照组;各组细胞分别培养至第6d时，用茜素红钙染色试剂盒对各组细胞进行染色，于倒置显微镜下拍照，观察钙结节形成的情况。结果：细胞茜素红染色：成骨诱导组可见典型阳性钙结节表现，而对照组呈现阴性。结论：人肾成纤维细胞在成骨诱导培养液的刺激作用下发生成骨分化;肾乳头成纤维细胞发生成骨分化，可能是形成肾钙化斑的细胞学基础。
【关键词】人肾成纤维细胞;成骨分化;肾乳头钙化斑;肾结石
【中图分类号】R336【文献标识码】B【文章编号】2095―8439（2015）04―0170―02
尿路结石的确切发病机理还没有完全明了，尤其是对它的起源部位。普遍认为肾乳头钙化斑块（Randall斑）被认为是结石形成最可能的起点，在诱导异质成核并最终形成结石的过程中起重要的作用。研究表明：肾组织发生成骨分化可能是肾钙化斑形成的原因[1-3]，但是何种细胞成分发生成骨分化仍不清楚。国内外已经发现，人体多种组织源成纤维细胞在体内外特殊条件下展现出巨大的成骨分化的潜能[4-5]。我们推测人肾成纤维细胞也存在成骨分化的潜力，其发生成骨分化可能是Randall斑形成的细胞基础。我们用传统成骨诱导液诱导细胞成骨转分化来验证我们的推测。
实验材料
1主要材料和方法
1.1主要材料
细胞茜素红钙染色试剂盒（美国杰美基因生物公司）：胎牛血清（美国 HyClone 公司），DMEM/F12（上海博升生物科技公司）;人肾成纤维细胞 （南京凯基生物科技发展有限公司）;细胞培养箱（美国 Forma Scientific公司）：倒置相差显微镜（德国 Zeiss 公司）。
1.2主要方法
1.2.1细胞的培养：配制成含10%胎牛血清培养液，直接培养细胞作为对照组;配制传统成骨诱导培养液（DMEM/F12+10% FBS+1%双抗+1%β甘油酸磷酸钠 +0.1%地塞米松+0.5%维生素 C）直接培养细胞作为诱导组。两天更换一次培养液，用PBS液体清洗。
1.2.2茜素红染色步骤：详见说明书，染色后倒置显微镜下拍照。
2结果
细胞茜素红染色：成骨诱导组可见典型阳性红色钙结节表现，而对照组呈现阴性;碱性磷酸酶染色：成骨诱导组可以见到典型的黑色块状的硫化钴沉淀物，而正常对照组染色结果阴性。
图1成骨诱导组茜苏红染色阳性（200×）
图2正常对照组茜素红染色阴性（200×）
3讨论
80多年前，Randall通过解剖尸肾，发现肾乳头钙化斑[6]。Evan等认为钙化斑的起始部位是肾小管上皮基底膜，其主要成分为羟基磷灰石，其于间质组织中逐渐延伸至肾乳头皮下[7]。Randall斑的机制尚未完全明了：（1）randall斑形成的细胞学基础是什么？（2）为什么randall斑的起源位于肾小管基底膜下的间质中，而不是肾小管腔内？
近来研究提示高钙尿症大鼠模型和患者的肾组织发生成骨分化可能是肾钙化斑形成的原因[1-3]，但是何种细胞成分发生成骨分化仍不清楚。有人认为肾小管上皮细胞发生成骨分化是肾乳头钙化斑的病理学基础，然而，这并不能解释肾钙化斑位于肾间质中这一基本事实[7]，国内外已经发现，人体多种组织源成纤维细胞在体内外特殊条件下展现出巨大的成骨分化的潜能[8]。结合我们的实验研究，人肾成纤维细胞于传统成骨诱导培养至6天时能够形成典型阳性钙结节而对照组呈阴性的事实表明该细胞发生了成骨分化。这说明人肾成纤维细胞存在成骨分化的潜能并可能是肾钙化斑形成的细胞学基础。
本实验存在不足之处，尽管上述指标染色结果呈阳性表现，但是还要从基因和蛋白的水平揭示成骨分化相关重要标志性因子如RUN2的表达，以充分说明成骨分化的存在;是什么病理因素（如高钙离子）导致成骨分化是下一步要研究的问题。揭示肾结石的起源问题可能为肾结石的防治提供理论依据。
[1]Jia Z， Wang S， Tang J， et al. Does crystal deposition in genetic hypercalciuric rat kidney tissue share similarities with bone formation？ Urology， 2014 ，83（2）：509.e7-14.
[2]何登，王少刚，唐锦辉，等. BMP2和MSX2在特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织表达的研究. 临床泌尿外科杂志，2012 ，12：881-885.
[3]何登，王少刚，唐锦辉，等.特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织中Runx2、Osterix的表达.华中科技大学学报，2013，42：172-175.
[4]李秀兰，张扬，师宜健等.体外诱导成纤维细胞成骨活性表达的研究[J].中国修复重建外科杂志，2006 ，20（2）：107-111.
[5]崔永锋，俞索静，吴承亮.成纤维细胞与成骨细胞交互作用的研究进展.医学综述.2008，14（23）：3560-3561.
[6]Randall A. The Origin and Growth of Renal Calculi. Journa 1937;105（6）：1009-27.
[7]Evan AP， Lingeman JE， Coe FL， et al.Randall of patients with nephrolithiasis begins in basement membranes of thin loops of Henle. Journa 2003;111（5）：607-16.
[8]郭丙涛.钙离子对GHS大鼠肾小管上皮细胞cbfa1和osterix表达的影响[硕士]：华中科技大学;2013.
【关键词】人肾成纤维细胞;成骨分化;肾乳头钙化斑;肾结石
【中图分类号】R336【文献标识码】B【文章编号】2095―8439（2015）04―0170―02
尿路结石的确切发病机理还没有完全明了，尤其是对它的起源部位。普遍认为肾乳头钙化斑块（Randall斑）被认为是结石形成最可能的起点，在诱导异质成核并最终形成结石的过程中起重要的作用。研究表明：肾组织发生成骨分化可能是肾钙化斑形成的原因[1-3]，但是何种细胞成分发生成骨分化仍不清楚。国内外已经发现，人体多种组织源成纤维细胞在体内外特殊条件下展现出巨大的成骨分化的潜能[4-5]。我们推测人肾成纤维细胞也存在成骨分化的潜力，其发生成骨分化可能是Randall斑形成的细胞基础。我们用传统成骨诱导液诱导细胞成骨转分化来验证我们的推测。
实验材料
1主要材料和方法
1.1主要材料
细胞茜素红钙染色试剂盒（美国杰美基因生物公司）：胎牛血清（美国 HyClone 公司），DMEM/F12（上海博升生物科技公司）;人肾成纤维细胞 （南京凯基生物科技发展有限公司）;细胞培养箱（美国 Forma Scientific公司）：倒置相差显微镜（德国 Zeiss 公司）。
1.2主要方法
1.2.1细胞的培养：配制成含10%胎牛血清培养液，直接培养细胞作为对照组;配制传统成骨诱导培养液（DMEM/F12+10% FBS+1%双抗+1%β甘油酸磷酸钠 +0.1%地塞米松+0.5%维生素 C）直接培养细胞作为诱导组。两天更换一次培养液，用PBS液体清洗。
1.2.2茜素红染色步骤：详见说明书，染色后倒置显微镜下拍照。
2结果
细胞茜素红染色：成骨诱导组可见典型阳性红色钙结节表现，而对照组呈现阴性;碱性磷酸酶染色：成骨诱导组可以见到典型的黑色块状的硫化钴沉淀物，而正常对照组染色结果阴性。
图1成骨诱导组茜苏红染色阳性（200×）
图2正常对照组茜素红染色阴性（200×）
3讨论
80多年前，Randall通过解剖尸肾，发现肾乳头钙化斑[6]。Evan等认为钙化斑的起始部位是肾小管上皮基底膜，其主要成分为羟基磷灰石，其于间质组织中逐渐延伸至肾乳头皮下[7]。Randall斑的机制尚未完全明了：（1）randall斑形成的细胞学基础是什么？（2）为什么randall斑的起源位于肾小管基底膜下的间质中，而不是肾小管腔内？
近来研究提示高钙尿症大鼠模型和患者的肾组织发生成骨分化可能是肾钙化斑形成的原因[1-3]，但是何种细胞成分发生成骨分化仍不清楚。有人认为肾小管上皮细胞发生成骨分化是肾乳头钙化斑的病理学基础，然而，这并不能解释肾钙化斑位于肾间质中这一基本事实[7]，国内外已经发现，人体多种组织源成纤维细胞在体内外特殊条件下展现出巨大的成骨分化的潜能[8]。结合我们的实验研究，人肾成纤维细胞于传统成骨诱导培养至6天时能够形成典型阳性钙结节而对照组呈阴性的事实表明该细胞发生了成骨分化。这说明人肾成纤维细胞存在成骨分化的潜能并可能是肾钙化斑形成的细胞学基础。
本实验存在不足之处，尽管上述指标染色结果呈阳性表现，但是还要从基因和蛋白的水平揭示成骨分化相关重要标志性因子如RUN2的表达，以充分说明成骨分化的存在;是什么病理因素（如高钙离子）导致成骨分化是下一步要研究的问题。揭示肾结石的起源问题可能为肾结石的防治提供理论依据。
[1]Jia Z， Wang S， Tang J， et al. Does crystal deposition in genetic hypercalciuric rat kidney tissue share similarities with bone formation？ Urology， 2014 ，83（2）：509.e7-14.
[2]何登，王少刚，唐锦辉，等. BMP2和MSX2在特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织表达的研究. 临床泌尿外科杂志，2012 ，12：881-885.
[3]何登，王少刚，唐锦辉，等.特发性高钙尿肾结石患者肾乳头组织中Runx2、Osterix的表达.华中科技大学学报，2013，42：172-175.
[4]李秀兰，张扬，师宜健等.体外诱导成纤维细胞成骨活性表达的研究[J].中国修复重建外科杂志，2006 ，20（2）：107-111.
[5]崔永锋，俞索静，吴承亮.成纤维细胞与成骨细胞交互作用的研究进展.医学综述.2008，14（23）：3560-3561.
[6]Randall A. The Origin and Growth of Renal Calculi. Journa 1937;105（6）：1009-27.
[7]Evan AP， Lingeman JE， Coe FL， et al.Randall of patients with nephrolithiasis begins in basement membranes of thin loops of Henle. Journa 2003;111（5）：607-16.
[8]郭丙涛.钙离子对GHS大鼠肾小管上皮细胞cbfa1和osterix表达的影响[硕士]：华中科技大学;2013.