为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸道综合征病毒(HP-PRRSV)的方法,本研究根据ASFV CP530R基因、CSFV 5’UTR基因和HP-PRRSV NSP2基因,分别设计了3对特异性引物和Taq Man水解探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明,该方法仅对ASFV、CSFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的DNA以及猪流行腹泻病毒和猪流感病毒的c DNA发生交叉反应;该方法对ASFV、CSFV和HP-PRRSV的最低检出量分别为61拷贝/μL、11拷贝/μL和41拷贝/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2.5%,具有良好的重现性。用该方法对276份临床样品进行ASFV、CSFV和HP-PRRSV的检测,所有样品的ASFV检测结果均为阴性,CSFV检测单阳性样品6份,HP-PRRSV检测单阳性样品22份,CSFV和HP-PRRSV检测双阳性样品4份。本研究建立的方法为临床样品中ASFV、CSFV和HP-PRRSV的同时检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。