猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyoneumoniae, Mhp）引起的猪的一种慢性呼吸道疾病。Mhp一般不会导致猪死亡,但能显著性降低猪的生产性能,临床上主要表现为发热、咳嗽和呼吸困难,且很容易引起猪群继发感染其他疾病,例如猪圆环病毒病、猪流感、伪狂犬病等病毒性疾病和胸膜肺炎、巴氏杆菌病、链球菌病等细菌性疾病,形成猪呼吸系统疾病综合征（Porcine respiration Disease Complex, PRDC）,给养猪业造成重大经济损失。目前最常用的Mhp疫苗候选抗原有Mhp183（P97）、 Mhp378、 Mhp677（P65）等,但根据它们制备的疫苗与传统疫苗相比,免疫效果并无太大差异。为了获得其他具有更好免疫保护效果的Mhp保护性抗原,需要对Mhp的蛋白进行筛选鉴定。本研究首先运用生物信息学相关软件筛选Mhp的候选疫苗抗原,主要是分泌蛋白和外膜蛋白。并将筛选出的mhpl68₁16、mhp168₃22、 mhp168₃41和mhpl68₅49基因进行了原核表达和纯化,再将融合蛋白进行小鼠免疫试验,分析其免疫原性,同时将融合蛋白与猪自然感染的猪肺炎支原体阳性血清反应,分析其反应原性,鉴定此四个候选疫苗抗原。本试验内容主要包括以下儿个方面：1.猪肺炎支原体部分作为候选疫苗抗原的分泌蛋白和外膜蛋白的生物信息学预测目的：通过生物信息学分析,预测Mhp候选疫苗抗原。方法：以猪肺炎支原体168菌株基因组序列为基础,选取部分Mhp168菌株的蛋白,用SignalP4.1预测这些蛋白的信号肽序列,用DAS、HMHMM软件预测蛋白的跨膜区,用CELLO version2.5预测蛋白的亚细胞定位,用BOMP预测蛋白是否具有β-桶状结构,将筛选得到的外膜蛋白和分泌蛋白作为候选疫苗抗原蛋白,将候选疫苗抗原蛋白通过BLAST序列比对分析这些蛋白氨基酸序列的保守性。结果：SignalP4.1软件预测出Mhp168₅49蛋白有信号肽。DAS软件预测Mhp168₁16、 Mhp168₃22、Mhp168₃41、Mhp168₅49均有跨膜区。HMHMM软件预测Mhp168₁16、Mhp168₃41、Mhp168₅49均在细胞膜外,Mhp168₃22序列N端的33～52位可能存在跨膜区,编码产物绝大部分位于细胞膜的外侧。CELLO version2.5软件预测出Mhp168₁16、 Mhp168₃41可能是分泌蛋白,Mhp168₃22可能是外膜蛋白或分泌蛋白,Mhp168₅49可能是分泌蛋白、周质蛋白或外膜蛋白。BOMP软件预测Mhp168₃22蛋白可能有β-桶状结构。综合上述结果：Mhp168₁16、Mhp168₃41、Mhp168₅49可能是分泌蛋白或外膜蛋白,Mhp168₃22可能是具有β-桶状结构的外膜蛋白。这些蛋白均具有良好的序列保守性。结论：Mhp168₁16、Mhp168₃22、Mhp168₃41和Mhp168₅49均可以作为Mhp候选疫苗抗原蛋白。2.非TGA编码Trp猪肺炎支原体候选疫苗抗原蛋白mhp168₁16、mhp168₃41、mhp168₅49基因的原核表达及纯化目的：获得纯化的原核表达Mhpl68₁16、Mhp168₃41、Mhp168₅49蛋白。方法：以猪肺炎支原体168株全基因组为模板,PCR扩增mhpl68₁16、mhp168₃41、 mhp168₅49基因,连接至pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-mhp168-116、 pGEX-6P-2-mhp168-341、 pGEX-6P-2-mhp168-549重组质粒。将经测序鉴定的上述重组质粒转化大肠杆菌XL-1感受态细胞,在终浓度为0.2mM IPTG30℃条件下诱导目的蛋白表达。三个经诱导目的蛋白表达的重组菌经谷胱甘肽beads纯化后PP酶酶切,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达。获得可溶性表达的融合蛋白GST-Mhp168₁16、GST-Mhp168₃41、 GST-Mhp168₅49,再用谷胱甘肽琼脂糖珠和PP酶进行纯化,通过鉴定蛋白的表达形式和表达结果：PCR扩增mhp168₁16、mhp168₃41、mhpl68₅49基因片段获得612bp、726bp、837bp大小预期条带,将基因片段连接原核表达载体pGEX-6P-2中,酶切鉴定表明成功地构建重组质粒pGEX-6P-2-mhp168-116、pGEX-6P-2-mhp168-341、pGEX-6P-2-mhp168-549,转化大肠杆菌XL-1感受态中,并成功进行表达与纯化,经SDS-PAGE鉴定分别得到48kDa、55kDa、57.5kDa的融合GST标签的Mhp168116、Mhp168₃41、Mhp168₅49重组蛋白。结论：Mhp168₁16、Mhp168₃41、Mhp168₅49蛋白能以具有良好天然构象的可溶形式在大肠杆菌XL-1中表达,并被谷胱甘肽Beads纯化。3.TGA编码Trp的猪肺炎支原体候选疫苗抗原蛋白mhp168₃22基因的原核表达及纯化目的：获得纯化的原核表达Mhp168₃22蛋白。方法：以猪肺炎支原体168株全基因组为模板,去掉编码信号肽序列的核苷酸片段,PCR扩增mhp168₃22基因片段连接至pMD19-T载体,构建重组质粒pMD19-T-mhp168₃22,经基因定点突变将编码Trp的密码子TGA突变为TGG,然后将该基因酶切后亚克隆入pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-mhp168₃22重组质粒。将重组质粒pGEX-6P-2-mhp168₃22转化大肠杆菌XL-1感受态,在终浓度0.2mM IPTG30℃条件下诱导表达目的蛋白,再用谷胱甘肽Beads和PP酶进行纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白的表达形式和表达量。结果：PCR扩增mhpl68₃22基因片段获得753bp大小预期条带,将基因片段连接到克隆载体pMD19-T中,酶切鉴定表明成功的构建重组质粒pMD19-T-mhp168₃22;对重组质粒pMD19-T-mhp168₃22进行点状突变,酶切突变质粒并测序验证,结果mhp168₃22基因片段中TGA被成功突变为TGG；构建载体pGEX-6P-2-mhp168₃22并成功进行表达与纯化,经SDS-PAGE鉴定得到55.2kDa的融合蛋白GST标签的Mhp168₃22重组蛋白。结论：Mhp168₃22能以具有良好天然构象的可溶形式在大肠杆菌XL-1中表达,并被谷胱甘肽Beads纯化。4. Mhp168₁16、 Mhp168₃22、Mhpl68₃41和Mhp168₅49蛋白的免疫原性和反应原性分析目的：检测Mhp168₁16、Mhp168₃22、Mhp168₃41、Mhp168₅49蛋白的免疫原性和反应原性。方法：将纯化后的融合蛋白GST-Mhp168₁16、GST-Mhp168₃22、GST-Mhp168₃41、 GST-Mhp168₅49分别免疫小鼠制备多克隆抗体。进行免疫印迹试验验证目的蛋白的免疫原性。以融合蛋白为抗原,ELISA试验检测抗血清抗体效价,分析其免疫原性。将四种蛋白与猪阳性血清反应,免疫印迹分析其反应原性。结果：融合蛋白GST-Mhpl68₁16、GST-Mhp168₃22、GST-Mhpl68₃41、 GST-Mhp168₅49与血清抗体发生特异性反应,出现相应条带。ELISA试验检测抗血清抗体效价,发现这四种蛋白具有较高的抗体效价,阳性率为100%。四种融合蛋白与猪阳性血清发生特异性反应,出现相应条带。结论：Mhp168₁16、Mhp168₃41、Mhp168₅49蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。