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一、目的:肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LADC)是肺癌最常见的组织学类型,它构成最致命的人类癌症,全球每年造成65万人死亡,在吸烟者、戒烟者和不吸烟者中的发病率正在增加。而且,LADC最常见的是从不吸烟的女性和年轻人,理解和治疗疾病势在必行。本实验主要研究中药单体薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肺腺癌细胞增殖迁移及侵袭能力的影响,以及对上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,以期为薯蓣皂苷的临床抗肺癌提供一定的理论依据。二、方法:(1)MAP3K3促进人肺腺癌细胞A549和H1299的上皮间质转化1、腺病毒转染,构建过表达MAP3K3的稳定株。2、克隆形成实验,检测过表达MAP3K3基因对细胞增殖的改变。3、划痕实验与Transwell小室实验,检测过表达MAP3K3基因后,人肺腺癌细胞的迁移和侵袭的改变。4、Western Blot实验检测过表达MAP3K3基因后EMT相关蛋白的表达,及AKT/p-AKT、mTOR/p-mTOR、GSK3 β/p-GSK3 β、JNK1/2/p-JNK1/2、ERK1/2/p-ERK1/2的表达。(2)薯蓣皂苷抑制人肺腺癌细胞A549和H1299的EMT的作用及机制研究1、运用CCK8实验来检测薯蓣皂苷对人肺腺癌细胞A549和H1299生长增殖活性的影响,以确定后续实验的薯蓣皂苷浓度。2、划痕实验和Transwell小室实验,检测薯蓣皂苷对人肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响。3、免疫荧光和Western Blot实验,检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、ZO-1、Snail、Slug等EMT相关蛋白的表达。4、Western Blot实验检测MAP3K3及其下游信号通路蛋白AKT/p-AKT、mTOR/p-mTOR、GSK3 β/p-GSK3 β、JNK1/2/p-JNK1/2、ERK1/2/p-ERK1/2 的表达。三、结果:(1)MAP3K3促进人肺腺癌细胞A549和H1299上皮间质转化1、克隆形成实验显示,过表达MAP3K3基因后,单克隆面积明显增大。2、划痕实验和Transwell小室显示,过表达MAP3K3后细胞划痕愈合率和穿膜数明显增加。3、Western Blot实验检测显示,过表达MAP3K3基因后能明显降低A549、H1299细胞E-cadherin的表达,同时提高N-cadherin、Vimentin的表达。过表达MAP3K3基因后明显提高了 A549、H1299 细胞 p-AKT、p-mTOR、p-GSK3 β、p-JNK 的表达,p-ERK有上调但不明显。(2)薯蓣皂苷抑制人肺腺癌细胞A549和H1299上皮间质转化的作用及机制研究1、CCK8显示,药物作用人肺腺癌细胞A549、H1299的增殖具有明显的抑制,又表现出时间浓度依赖的关系。2、划痕实验和Transwell小室实验显示,薯蓣皂苷能够明显地抑制A549、H1299的迁移与侵袭,并呈现出浓度依赖性。3、免疫荧光及Western Bolt检测,药物干扰24h,可明显增加A549、H1299细胞 ZO-1,Claudin-1,E-cadherin 等蛋白表达,降低 N-cadherin、Vimentin、ZEB1、MMP9等蛋白表达。4、Westeern Bolt实验检测显示,通路蛋白MAP3K3、p-Akt、p-mTOR、p-GSK3 β、表达下调,p-JNK1/2、p-ERK1/2均明显上调。四、结论:1、过表达MAP3K3基因可以促进人肺腺癌细胞A549、H1299上皮间质转化2、薯蓣皂苷可以明显地抑制A549、H1299细胞的侵袭、转移及上皮间质转化,可能是通过MAP3K3/AKT/mTOR/GSK3 β信号通路的调控。薯蓣皂苷干预后JNK、ERK信号通路被激活,但磷酸化的JNK、ERK皆明显上调,表明药物可能不是通过MAP3K3介导JNK和ERK信号通路的激活,可能存在其他信号传导,且磷酸化的JNK和ERK的上调或下调皆有文献报道,有待进一步探讨。