研究背景和目的花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是一种人体内含量最丰富、性质最活跃、分布最广泛的多不饱和脂肪酸,其代谢物具有广泛且很强的生物活性,其代谢网络是生物体内多种信号及内源性活性物质代谢网络的重要组成部分。在各种生理性刺激作用下,细胞膜磷脂被磷脂酶A2脂解释放出AA, A A可以被环氧化酶、脂加氧酶和细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)氧化酶等三种不同的酶途径进行代谢。CYP氧化酶又包括ω/ω-1羟化酶和表氧化酶(也有称为环加氧酶)。经CYP表氧化酶途径AA可代谢为四种不同的环氧化二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs),即5,6-EET, 8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET。EETs可被可溶性表氧化水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH)水解为弱生物学活性的二羟基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)。CYP表氧化酶-EETs系统在体内各个系统都发挥重要的生物学作用,尤其心血管系统。EETs可以激活血管平滑肌高电导Ca2+活化的K+通道引起血管平滑肌细胞超极化,进而导致血管舒张,血压降低；EETs可通过激活MAPK与PI3K/AKT信号通路促进内皮细胞增殖迁移与新生血管形成,促进血管重构；EETs通过可以上调内皮细胞eNOS的表达与NO的释放；EETs含量增加还可抑制内皮细胞凋亡；可以抗氧化应激、抗血小板、促纤溶；EETs还可以减少细胞因子诱导内皮细胞粘附分子的上调,抑制淋巴细胞粘附到血管壁上的,抑制核转录因子(NF-κB)的活化,激活PPARa受体,抑制单核细胞／巨噬细胞活化及活化后引起的级联反应,在多种炎症性疾病中发挥抗炎效应。另外,EETs与胰岛功能密切相关,可刺激大鼠离体胰岛分泌胰岛素和胰高血糖素,本实验室已证明CYP2J3过表达逆转了糖尿病鼠各器官的胰岛素抵抗,提示CYP2J是治疗糖尿病的一个可能靶点,但是目前CYP2J改善糖尿病的机制仍未完全明确。糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一种因体内胰岛素分泌相对或绝对不足引起的以糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱为特征的慢性进行性代谢异常综合征,是一种全身性代谢紊乱性疾病,其大血管和微血管并发症严重威胁人类健康,约70%的糖尿病患者由于合并心脑血管并发症而死亡,目前医学界已基本达成了“2型糖尿病是冠心病的等危症”这一共识,糖尿病已经成为严重的社会问题。糖尿病包括1型DM,2型DM,妊娠期糖尿病以及其他特殊类型的DM。其中2型DM占糖尿病90%以上且发病率逐年增加,其发病的中心环节是胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和p细胞功能衰竭,进而导致心脑血管系统和肾脏等器官的多种严重并发症,甚至死亡。大量的实验证据表明糖尿病与高血压,血脂异常,血糖代谢异常,肥胖等因素有关。随着对2型糖尿病以及胰岛素抵抗本质的认识不断深化研究,结果发现氧化应激、炎症反应机制参与了IR与内皮功能紊乱,而炎症反应成为IR、胰岛β细胞功能减退与代谢综合征及心血管并发症的“共同的土壤”。从本质上讲,糖尿病是一种与慢性亚临床非可控性炎症反应有关的疾病,研究显示,T2DM常伴有血液中急性期反应标记物浓度升高,先天性免疫反应激活和慢性炎症过程,在糖尿病的发病机制中起媒介作用。炎症因子水平的升高直接损害血管内皮,易于形成血栓和栓塞,同时加重了患者的血脂紊乱,从而加速了糖尿病血管病变的发展。大量证据表明,在DM发生发展过程中,炎症因子通过氧化应激激活核因子(nuclear factor-KB, NF-κB)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、抑制物激酶(IKK)以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)等系统,抑制胰岛素的磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路,减弱了胰岛素信号转导,引起IR。肝脏是葡萄糖代谢的主要场所外,还是分泌释放炎症因子的器官,尤其在进行性加重的糖尿病有关的肝脏疾病病理生理过程中,肝脏由胰岛素抵抗诱导的NF--κB激活入核是至关重要的一环。临床研究证实血清中TNF-α和IL-1p水平升高是糖尿病和胰岛素抵抗的危险因素,抗炎治疗已经成为治疗糖尿病的新的途径。在本研究中,我们假设过表达CYP2J2,使EETs的产生增加,抑制了炎症信号,从而在改善IR,延缓DM的进展中具有重要的保护作用。因此,在db/db2型DM小鼠模型中,我们研究了CYP2J2基因治疗对DM、IR和炎症的影响以及可能的分子机制,并在体外研究外源性EETs及CYP2J2表达对HepG2细胞胰岛素抵抗模型IR及炎症的影响及其可能的分子机制,旨在从整体动物水平和细胞水平明确CYP2J2-EETs系统是否能够改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,以及是否能够减轻肝脏炎症反应,进一步明确CYP2J2-EETs系统是否能够延缓2型糖尿病的进展。一、体内实验细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达抑制了2型糖尿病模型db/db小鼠的肝脏炎症,减轻了胰岛素抵抗实验目的：探讨CYP2J2基因体内过表达是否能够改善2型糖尿病db/db小鼠胰岛素抵抗及其分子机制是否与抗炎有关。实验方法：1.三质粒钙磷共转染包装制备rAAV-GFP和rAAV-CYP2J2病毒：将CYP2J2基因克隆入重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus-mediated-rAAV)双链表达载体中,碱裂解法大量提取质粒pXXUF1-2J2、pXX8和phelper,氯化铯—溴化乙锭梯度平衡离心法纯化质粒,293细胞中经三质粒钙磷共转染方法包装制备rAAV-2J2病毒和带有绿色荧光蛋白GFP的rAAV-GFP病毒,纯化后经real-time PCR法检测病毒滴度。2.实验动物的处理：8周龄健康雄性C57BL/6与2型糖尿病db/db小鼠各60只适应性喂养1周后,各随机分为6组,分别为：C57BL/6组注射生理盐水,C57BL/6+rAAV-GFP组,C57BL/6+rAAV-CYP2J2组,C57BL/6+GW9662组,C57BL/6+rAAV-GFP+GW9662组,C57BL/6+rAAV-CYP2J2+GW9662组,db/db组注射生理盐水,db/db+rAAV-GFP组,db/db+rAAV-CYP2J2组,db/db+GW9662组,db/db+rAAV-GFP+GW9662组,db/db+rAAV-CYP2J2+GW9662组。GFP组和CYP2J2组小鼠按照体重经尾静脉注射携带目的基因的病毒溶液1×1011p.f.u/只,GFP组给予rAAV-GFP病毒溶液,2J2组给予rAAV-2J2病毒溶液,其他组给予同等体积的生理盐水注射。病毒注入8周后相关组按照小鼠体重进行PPAR gamma抑制剂GW9662灌胃,剂量为1mg/kg/day,持续4周后处死动物；3.实验过程中每两周称次实验动物体重,尾静脉抽血直至实验结束。进行口服葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量试验;实施高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验；基因转染12周后留取血标本及24小时尿标本,处死动物,留取血液标本；取心脏,主动脉,胰腺,脂肪,肝脏,骨骼肌,脂肪,肾脏标本放入液氮冷冻后转入-80℃低温冰箱保存备用,以上组织标本各取少部分放入4%甲醛溶液中固定,脱水浸腊石蜡包埋后备用；4.口服葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验的方法检测CYP2J2基因过表达对2型糖尿病db/db小鼠胰岛素抵抗的影响；5.高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验检测CYP2J2基因过表达对2型糖尿病db/db小鼠对胰岛素的敏感性及全身葡萄糖代谢情况；6. ELISA法检测小鼠血清胰岛素与尿中14,15-DHET的含量；应用葡萄糖氧化酶法检测血清中血糖浓度,应用相应试剂盒检测相应血脂的浓度；7. ELISA法检测小鼠血清中炎症因子IL-1β, IL-6, TNF-α和CRP的含量,采用实时定量PCR检测小鼠肝脏组织中炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α,CRP和PPAR gamma的mRNA水平；采用实时定量PCR检测肝脏中葡萄糖代谢相关酶G6P, PEPCK及GCK的mRNA表达水平；8.应用Western blot的方法检测db/db小鼠肝脏中CYP2J2和PPAR gamma的表达；检测db/db与C57BL/6小鼠肝脏中P-Y989-IRS-1, P-S307-IRS-1, PI3K, P-S473-AKT, P-ERK, P-C-JUN与核中NF-κB的表达。实验结果：1. Western Blot结果显示,在rAAV-2J2基因通过尾静脉注射导入小鼠体内3个月后,db/db小鼠肝脏中CYP2J2蛋白显著表达,ELISA法检测小鼠体内EETs水平证实C57BL/6+rAAV-2J2组小鼠尿液中14,15-DHET的含量是30.66±3.82 ng/ml,显著高于C57BL/6组小鼠(8.32±2.41 ng/m1)和C57BL/6+rAAV-GFP组小鼠(6.53±1.89ng/ml)(P<0.05),CYP2J2基因转入的db/db+rAAV-2J2组小鼠尿液中14,15-DHET的含量是35.52±4.26ng/ml,显著高于db/db组小鼠的(6.73±1.45 ng/m)1和转入GFP基因的db/db+rAAV-GFP组小鼠(5.88±1.24 ng/ml)(P<0.05), GW9662干预后,处理对小鼠尿液中14,15-DHET的含量无太大影响,db/db+rAAV-2J2+GW9662组小鼠尿液中14,15-DHET的含量34.22±3.56ng/ml仍旧高于db/db+GW9662组的(7.14±2.12 ng/ml)和db/db+rAAV-GFP+GW9662组(5.84±1.38 ng/m1) (P<0.05),而db/db+rAAV-2J2+GW9662组与db/db+rAAV-2J2组相比无显著性差异(P>0.05)。这些结果证实CYP2J2可以获得在小鼠肝脏持久稳定高表达,并且显著提高了体内EETs水平,GW9662不影响CYP2J2的代谢。2.各种糖脂代谢指标结果显示,作为对照的C57BL/6小鼠各组间明显差异(P>0.05)。db/db小鼠则呈现出显著的糖脂代谢紊乱,与C57BL/6小鼠相比血糖,血胰岛素,甘油三酯和胆固醇均显著升高(P<0.05)。与重组腺相关病毒介导的rAAV-GFP相比,rAAV-CYP2J2基因的转入显著降低了db/db小鼠的血糖和血胰岛素水平,甘油三酯和胆固醇水平也有明显下降(P<0.05),而rAAV-GFP的导入对db/db小鼠体内的四个参数无明显影响(P>0.05),GW9662干预后抑制了CYP2J2对血脂代谢的影响(P<0.05)。3.口服葡萄糖耐量实验结果显示,C57BL/6小鼠各组之间的葡萄糖负荷前后的血糖水平变化趋势均无明显差异(P>0.05)。与C57BL/6小鼠相比,六组db/db小鼠的糖耐量实验之前空腹血糖的水平与葡萄糖负荷之后血糖的水平均显著升高(P<0.05)(图1-5A)；然而,结果显示rAAV-2J2基因的转入使db/db+rAAV-2J2组在0、30、60、120min血糖浓度(16.35±3.03) mmol/L、(22.83±2.04) mmol/L、(18.74±1.38) mmol/L、(16.08±3.06) mmol/L,与db/db+rAAV-GFP组(24.9±3.06)mmol/L、(33.6±1.24)mmol/L、(37.95±1.34)mmol/L、(27.26±2.79)mmol/L均相比明显下降(P<0.05)。但是,GW9662干预4周db/db+rAAV-2J2+GW9662组在0、30、60、120min血糖浓度(21.48±2.48) mmol/L、(28.14±1.66) mmol/L、(31.95±2.16) mmol/L、(21.57±1.6) mmol/L与db/db+rAAV-2J2组相比显著升高(P<0.05),表明PPARgamma抑制明显逆转了CYP2J2的作用。4.胰岛素耐量实验结果显示,为了检测基因注入后对小鼠胰岛素敏感性的影响,小鼠进行了胰岛素耐量实验。C57BL/6小鼠在胰岛素负荷后空腹血糖迅速降低,相反,六组db/db小鼠在胰岛素负荷后血糖浓度占基础血糖值的百分比均高于于C57BL/6组(P<0.05)；然而,实验结果显示rAAV-2J2基因的转入使db/db+rAAV-2J2组在15、30、60、120 min血糖浓度占自身基础血糖百分比83.16±2.56%、69.29±3.76%、56.22±2.6%、61.56±6.56%显著低于db/db+rAAV-GFP组90.34±2.08%、87.13±2.98%、75.83±6.69%、84.32±6.83%(P<0.05)。GW9662干预4周后db/db+rAAV-2J2+GW9662组60、120 min血糖浓度占自身基础血糖百分比分别为68.41±3.18%、75.85±2.62%,明显高于db/db+rAAV-2J2组(P<0.05),证明2J2高表达显著改善了糖尿病动物胰岛素耐受性。5.高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验结果显示,C57BL小鼠的葡萄糖输注率,全身葡萄糖摄取,肝脏特异性葡萄糖摄取量,全身葡萄糖转换量远远高于db/db小鼠(P<0.05),肝糖原输出明显小于db/db小鼠(P<0.05)。CYP2J2基因导入后显著升高db/db小鼠的葡萄糖输注率,全身葡萄糖摄取,肝脏特异性葡萄糖摄取量和全身葡萄糖通量(P<0.05),降低了肝糖输出量(P<0.05),GW9662处理部分抑制了CYP2J2的作用。6.实时定量PCR检测小鼠肝脏中葡萄糖代谢相关酶G6P, PEPCK及GCK的mRNA水平与钳夹试验中得到的一致,即与C57B/6小鼠相比,db/db小鼠肝脏组织中的G6P和PEPCK的mRNA水平升高,GCK mRNA表达水平下调(P<0.05),CYP2J2下调了db/db小鼠肝脏组织中的G6P和PEPCK的mRNA水平,上调了GCK mRNA水平(P<0.05),改善了肝脏中的葡萄糖代谢,GFP对三种酶的mRNA水平影响不大。7.炎症相关指标检测结果：ELISA示db/db各组小鼠血清中IL-1β、IL-6, TNF-α和CRP的浓度均明显高于C57BL小鼠(P<0.05)。db/db小鼠中,生理盐水组与GFP组各炎症因子血清浓度无显著差异(P>0.05),与生理盐水组和GFP组相比,rAAV-2J2的导入显著下调血清中四种炎症因子的水平(P<0.05),GW9662的干预增高了db/db+CYP2J2组血清中四种炎症因子浓度(P<0.05)。实时定量PCR显示,C57BL/6小鼠各组之间的炎症因子IL-1β, IL-6, TNF-α、CRP及PPARy的mRNA含量无明显差异(P>0.05),db/db小鼠肝脏中IL-1β, IL-6, TNF-α和CRP的mRNA水平显著增高,PPARγmRNA水平增高(P<0.05),rAAV-CYP2J2基因的转入显著下调了db/db小鼠肝脏中四种炎症因子的mRNA水平,上调了PPARy的mRNA水平,而rAAV-GFP对这些炎症因子参数几乎没有影响,而GW9662的干预使CYP2J2组的四种炎症因子和PPARy的mRNA水平上调(P<0.05)。Western blot检测了小鼠肝脏组织中PPAR gamma和细胞核中NF-κB的蛋白表达水平,结果发现C57BL/6小鼠各组之间PPAR gamma和NF-κB的蛋白表达水平相差很小(P>0.05),db/db小鼠肝脏细胞核中NF-κB的蛋白表达显著增加,提示2型糖尿病db/db小鼠体内炎症异常活跃,胰岛素抵抗状态下炎症通路被激活,NF-κB入核增多,而rAAV-CYP2J2基因过表达显著下调NF-κB在肝脏细胞核中的表达水平,上调PPAR gamma mRNA表达水平,抑制NF-κB入核,减轻胰岛素抵抗中的肝脏炎症。rAAV-GFP组对肝脏的PPAR gamma和细胞核中NF-κB的蛋白表达不产生影响。8.Western blot检测结果显示,与C57BL/6小鼠相比较,db/db组与db/db+ rAAV-GFP组小鼠肝脏中P-S473-AKT表达水平显著降低(P<0.05),而P-ERK与P-JNK的表达水平显著升高(P<0.05)；在db/db小鼠体内过表达CYP2J2显著上调了肝脏中P-S4732-AKT的表达水平(P<0.05),同时显著阻止了肝脏中MAPK的表达水平的升高(P<0.05)。二、体外实验CYP2J2过表达通过抑制炎症改善HepG2细胞的胰岛素抵抗实验目的：探讨CYP2J2过表达对HepH2细胞胰岛素抵抗模型的影响及其分子机制是否与抗炎有关。实验方法：1.用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养HepG2细胞,培养瓶平放于37℃,含5%CO2的培养箱中。当细胞单层生长至大约90%汇合时0.25%胰蛋白酶消化传代,镜下观察细胞生长至70%-80%汇合时,弃掉培养基,改换含0.1%胎牛血清的DMEM培养基过夜,饥饿培养12 h,再进行后续处理。2.重组腺相关病毒介导的rAAV-CYP2J2和rAAV-GFP基因转染HepG2细胞,转染24h后加入GW9662,2h后PA处理24h诱导细胞发生胰岛素抵抗；3. ELISA和实时定量PCR检测HepG2细胞上清中的IL-1β, IL-6,TNF-α和CRP水平；4.经过干预的HepG2细胞,提取总蛋白和核蛋白Western blot方法检测CYP2J2, PPAR gamma, AKT, MAPK, NF-κB的蛋白表达；5.经过干预的HepG2细胞,加入同位素14C标记的2-脱氧-葡萄糖和胰岛素的混合液,闪烁记数仪计算HepG2细胞对葡萄糖的摄取率。实验结果：1. Western Blot结果显示,在rAAV-2J2转染的HepG2细胞组CYP2J2蛋白显著表达,明显高于rAAV-GFP组和生理盐水组(P<0.05)。2.炎症相关指标检测结果：ELISA示PA诱导的胰岛素抵抗细胞上清中的IL-1β、IL-6, TNF-α和CRP的浓度均明显高于无处理的HepG2细胞(P<0.05)。PA组与PA+rAAV-GFP组各炎症因子浓度无显著差异(P>0.05),PA+rAAV-2J2四种炎症因子的水平与PA+rAAV-GFP组相比明显下调(P<0.05),GW9662的处理使PA+rAAV-2J2组的四种炎症因子的水平上调(P<0.05)实时定量PCR显示,PA未处理组之间的四种炎症因子IL-1β, IL-6, TNF-α、CRP及PPARγ的mRNA含量无明显差异(P>0.05),PA诱导的HepG2胰岛素抵抗模型中IL-1β, IL-6, TNF-α、CRP及PPARγ的mRNA水平显著增高(P<0.05),rAAV-CYP2J2基因的转入显著下调了PA诱导的HepG2胰岛素抵抗模型四种炎症因子的mRNA水平,上调了PPAR gamma的mRNA水平,而rAAV-GFP对这些炎症因子参数几乎没有影响,GW9662削弱了CYP2J2对IL-1β, IL-6,TNF-α、CRP及PPARy的mRNA表达是影响。Western blot检测了HepG2细胞中PPARγ和细胞核中NF-κB的蛋白表达水平,结果发现PA未处理细胞组之间PPAR gamma和NF-κB的蛋白表达水平相差很小(P>0.05),PA诱导的HepG2胰岛素抵抗模型组细胞核中NF-κB的蛋白表达显著增加,提示肝脏胰岛素抵抗时炎症通路被激活,NF-κB入核增多,提示炎症参与了胰岛素抵抗的病理生理过程,而rAAV-CYP2J2基因过表达显著下调NF-κB在细胞核中的表达水平,上调PPAR gamma mRNA表达水平,提示rAAV-CYP2J2基因过表达通过抑制NF-κB入核,减轻胰岛素抵抗中的肝脏炎症。rAAV-GFP组对肝癌洗吧中的PPARgamma和细胞核中NF-κB的蛋白表达不产生影响3.Western blot检测结果显示,PA处理的HepG2细胞中P-ERK和P-JNK表达增高,rAAV-CYP2J2基因过表达显著下调了胰岛素抵抗HepG2细胞中P-ERK和P-JNK,上调了P-AKT以及PPARy的蛋白表达,提示EETs激活了AKT与PPARy信号转导通路,在胰岛素抵抗中抑制了MAPK信号途径。4.2-DG摄取实验结果显示,rAAV-CYP2J2基因过表达显著促进了高脂负荷后HepG2对葡萄糖的摄取,rAAV-GFP无此作用,GW9662干预削弱了CYP2J2促进葡萄糖吸收的能力。统计学分析用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据均以均数±标准误表示,各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学意义。结论1.在C57BL/6与db/db小鼠体内CYP2J2基因得到稳定持久表达,将花生四烯酸代谢为EETs并发挥生物学作用。2. CYP2J2基因过表达显著改善db/db 2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗,其分子机制可能是通过CYP2J2过表达抑制肝脏的炎症反应,包括CYP2J2过表达抑制肝脏中NF-κB入核和P-ERK. P-JNK通路的激活,抑制小鼠体内炎症因子表达分泌,激活PPARy表达。3.外源性CYP2J2高表达改善了HepG2细胞的胰岛素抵抗和炎症反应,包括CYP2J2高表达抑制细胞的NF-κB入核和P-ERK. P-JNK通路的激活,改善PA诱导的胰岛素抵抗。4. CYP2J2-EETs系统通过改善胰岛素抵抗,提高外周组织对胰岛素的敏感性,抑制炎症因子表达释放,抑制炎症信号通路的激活,最终延缓胰岛素抵抗和2型糖尿病的进展,起到治疗2型糖尿病的作用。5.本实验的结果为将来寻找胰岛素抵抗与糖尿病新的治疗靶点和防治策略,开发新型药物提供了新的理论指导和研究方向。总结：CYP2J2-EETs通过抑制肝脏的炎症因子表达释放和炎症信号通路的激活,促进肝脏PPARγ的激活提高了外周组织对胰岛素的敏感性,改善了胰岛素抵抗和2型糖尿病的进展。