【研究背景】恶性黑素瘤（malignant melanoma）是一类起源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤,该病是皮肤恶性肿瘤中的高发肿瘤之一,恶性程度高,易转移,预后差,目前尚无满意的治疗方法。黑素瘤细胞可塑性（melanoma cell plasticity）和表型可塑性（melanoma phenotype plasticity）使黑素瘤细胞在生长、迁移和恶性进展过程中不断改变自身的生物学行为能力,以适应肿瘤微环境的变化。因此,黑素瘤细胞可塑性的研究对于揭示黑素瘤的基本特性和指导临床治疗都具有重要意义。目前对于黑素瘤细胞可塑性的概念还没有统一的认识,可能涉及以下几个方面:表现出其他细胞所具有的表型、动态变化的细胞形态和生长方式、恶性进展的生物学行为（增殖、分化、浸润和转移等）,相关机理的阐明将揭示黑素瘤调控的新机制,并且为临床治疗提供理论依据。毒蕈碱型胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor,mAChR）属于G蛋白偶联受体家族,目前已经克隆出五种mAChR亚型（即M1-M5）,并且根据这些受体与G蛋白结合能力的不同进一步分为两个功能群,作为G蛋白偶联受体的mAChR可能通过不同亚型介导的多种细胞内信号机制调控细胞的生物学行为,并且参与肿瘤细胞的增殖和侵袭过程,其中M3毒蕈碱型胆碱受体参与其他多种恶性肿瘤增殖方面的结果并不一致,我们前期的研究结果提示M3毒蕈碱型胆碱能受体可能激活PLC和胞内钙离子,参与黑素瘤增殖的调控。p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,是一种神经营养因子低亲和性受体。研究表明黑素瘤中毒蕈碱型胆碱受体亚型和神经生长因子受体p75NTR（CD271）参与黑素瘤生物学功能调控,但具体机制不清。【研究目的】研究M3毒蕈碱型胆碱能受体和p75NTR的相互作用及其在黑素瘤恶性进展中的作用,为临床治疗提供理论依据。【实验方法】我们从组织病理、细胞水平研究了黑素瘤的形态学特征和转化过程,并运用分子生物学方法,分析了M3毒蕈碱型胆碱受体对黑素瘤细胞形态转化、增殖和侵袭能力等生物学功能的影响。利用蛋白芯片筛选、免疫共沉淀、免疫荧光染色、钙离子成像、药理学等方法,研究黑素瘤细胞M3毒蕈碱型胆碱能受体与p75神经营养素受体（p75NTR）的相互作用,并且阐明了M3-P75NTR-CDK1信号通路在黑素瘤增殖和侵袭中的作用,运用裸鼠成瘤动物模型对M3-P75NTR-CDK1信号通路进行了在体功能验证。【研究结果】1.组织病理和体外细胞培养提示黑素瘤细胞具有形态转化潜能选取处于不同生长阶段的黑素瘤病理标本（分别为黑素瘤原位癌、浅表扩散型黑素瘤、垂直生长阶段结节状黑素瘤和淋巴结转移阶段黑素瘤）,分析苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staing,HE染色）病理切片的不同细胞类型。结果显示,黑素瘤病理组织中可以检测到形态多样的肿瘤细胞,如Pagetoid样细胞（一类用于鉴别黑素瘤原位癌的细胞类型,胞体形态大、多角形、胞质灰染、核分裂相异常）、突破基底膜的上皮样瘤细胞（胞浆丰富、颗粒状细胞核,分裂显著）、纺锤样瘤细胞（胞核浓染）、多核黑素瘤细胞（染色质浓密、核仁不明显）。在同一病理组织内的肿瘤细胞形态异质性也十分明显,包括核浓染小细胞、纺锤样瘤细胞、上皮样瘤细胞等。黑素瘤病理细胞形态结果表明:在不同进展阶段,黑素瘤组织中上皮样黑素瘤数量所占比例超过97%,远远高于纺锤状间叶细胞的比例。比较体外培养的黑素瘤细胞系WM793B（浅表扩散阶段）、451Lu（垂直生长阶段）和A2058（侵袭转移阶段）和黑素瘤病理组织内的肿瘤细胞形态特性。结果显示黑素瘤在浅表扩散和垂直生长阶段,病理切片中的细胞形态与体外培养的肿瘤细胞系（WM793B和451Lu）形态相似,均以上皮样细胞为主。然而,体外培养的侵袭转移阶段黑素瘤细胞系A2058以纺锤样间叶细胞为主,这与病理组织中的细胞形态特征完全不同。结果提示:黑素瘤在体内恶性侵袭过程中具有细胞形态转化的潜能,而这种形态转化可能是体内恶性黑素瘤维持上皮样细胞形态的潜在原因,我们对此进一步研究。2.黑素瘤细胞形态可塑性的新表现:侵袭诱发的状态转化（invasiveness-triggered state transition,ITST）在划痕试验中,迁移进入划痕的A2058黑素瘤细胞在12 h、24 h、48 h后,基本保持纺锤状间叶样细胞形态,与原有细胞形态相似,提示黑素瘤细胞在水平迁移过程没有显著的形态学可塑性改变。而Transwell小室实验显示A2058黑素瘤细胞穿过Transwell小室微孔后形态发生显著变化。结果表明恶性黑素瘤细胞垂直侵袭后形态学发生显著改变,主要包括两个阶段。第一阶段（72小时内）由最初的纺锤状间叶样转变为上皮细胞样形态,第二阶段（96小时后）逐渐恢复至纺锤状间叶样细胞形态。黑素瘤细胞穿过transwell小孔后形态学发生了显著改变,我们称之为侵袭诱发的状态转化（invasiveness-triggered state transition,ITST）。ITST可能是体内恶性黑素瘤维持上皮样细胞形态的潜在原因。运用免疫学荧光染色方法,我们检测了上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）表达标志物E-cadherin、N-cadherin、desmoplakin、Vimentin在A2058黑素瘤细胞中的表达水平。结果显示E-cadherin在上皮样黑素瘤细胞中高表达,在纺锤状间叶样黑素瘤细胞中低表达;Vimentin在上皮样黑素瘤细胞中低表达,在纺锤状间叶样黑素瘤细胞中显著高表达,desmoplakin、N-cadherin变化不明显。结果提示:黑素瘤细胞外在形态改变过程伴随EMT表达标志物转化,其中E-cadherin和Vimentin最为显著。3.M3毒蕈碱型胆碱受体调节黑素瘤增殖、侵袭以及ITST我们设计了M3毒蕈碱型胆碱能受体siRNA,运用Western blot进行验证。MTT法检测M3 siRNA对黑素瘤细胞增殖能力的影响,结果提示M3 siRNA能显著抑制黑素瘤A2058细胞增殖,抑制效果在24 h最显著,48 h抑制率逐渐降低。Transwell小室实验检测M3 siRNA对细胞侵袭能力和细胞形态的影响。结果显示:M3 siRNA显著抑制黑素瘤细胞总数,显著降低上皮样细胞的绝对数量和百分比,显著增加间叶样细胞的绝对数量和百分比。4.M3毒蕈碱型胆碱受体潜在靶点和信号通路筛选和鉴定为了进一步研究M3毒蕈碱型胆碱受体的作用机制,我们运用蛋白芯片分析结合siRNA干扰方法对M3毒蕈碱型胆碱受体潜在靶点和信号通路进行筛选和鉴定,结果显示:在157个磷酸化蛋白中,M3 siRNA处理组中的17个磷酸化蛋白上调;6个磷酸化蛋白下调;其余134个磷酸化蛋白不变。KEGG pathway和STRING分析表明:M3 siRNA影响多个肿瘤相关信号通路和分子的表达,其中包括神经生长因子受体相关分子和信号通路。结果提示M3毒蕈碱型胆碱能受体（编码基因CHRM3）可能与p75NTR（编码基因NGFR）存在相互作用,p75NTR可能是M3毒蕈碱型胆碱能受体的潜在作用靶点。5.CDK1是M3-p75NTR相互作用的下游分子我们进一步探索了M3毒蕈碱型胆碱受体发挥作用的信号通路。生信分析提示CDK1是M3-p75NTR相互作用的下游分子。蛋白芯片和药理学结果显示M3 siRNA能引起p-CDK1表达下调,Western blot结果表明M3 siRNA能下调p75NTR和p-CDK1的表达。我们提出M3-P75NTR-CDK1信号通路参与黑素瘤增殖、侵袭等功能。6.M3-p75NTR-CDK1通路调节黑素瘤细胞增殖和侵袭为了明确M3毒蕈碱型胆碱受体与p75NTR相互作用,我们利用免疫荧光染色方法检测这两个分子在黑素瘤细胞A2058的表达情况,结果显示二者可以共表达,但在不同形态的细胞上情况有所不同,其中纺锤状间叶样细胞中M3毒蕈碱型胆碱能受体与p75NTR高度重合,而在上皮样细胞中M3毒蕈碱型胆碱能受体可以呈现单独存在状态。免疫共沉淀证明M3毒蕈碱型胆碱能受体和p75NTR存在相互作用。药理学结果显示M3毒蕈碱型胆碱能受体激动剂Pilocarpine增强黑素瘤增殖和侵袭,可以诱发细胞内钙离子增加反应,p75NTR抑制剂NSC49652显著抑制上述反应。Western blot实验表明Pilocarpine显著上调黑素瘤细胞M3、p75NTR、p-CDK1、p-AKT,这些反应也能被NSC49652显著抑制。结果提示M3毒蕈碱型胆碱能受体激活诱发的细胞增殖和侵袭能力增强是通过p75NTR实现的,M3-P75NTR-CDK1信号通路参与体外黑素瘤细胞生物学功能调控。7.M3-p75NTR-CDK1通路参与体内黑素瘤生长和恶性进展为了验证M3毒蕈碱型胆碱能受体及M3-p75NTR-CDK1信号通路在体内黑素瘤恶性进展的作用,我们构建了红色荧光标记的黑素瘤细胞A2058-m Cherry。免疫荧光检测结果表明:M3 siRNA能抑制m Cherry和细胞核标志物DAPI的荧光强度相对值,结果提示:M3 siRNA显著抑制黑素瘤细胞A2058-m Cherry的细胞增殖和M3蛋白。裸鼠成瘤实验表明:黑素瘤细胞A2058-m Cherry注射1-6周后逐渐形成肿瘤,对照组肿瘤体积（mm~3）分别为0、0、89.2、822.8、1463.0、2128.0;M3 siRNA组肿瘤体积（mm~3）分别为0、0、37.2、104.6、192.0、246.7。活体荧光成像结果显示裸鼠成瘤6周后对照组和siRNA组肿瘤荧光值（p/sec/cm~2/sr/m W/cm~2×10~9）分别为7.8和3.2。结果提示:M3毒蕈碱型胆碱能受体参与体内黑素瘤生长,M3 siRNA具有抑制作用,可以缓解黑素瘤恶性进展。形态学结果表明黑素瘤组织团块中m Cherry阳性细胞形态以上皮样细胞最显著。免疫荧光染色结果表明:与Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等EMT标志物相比,M3受体能更好地反映出黑素瘤细胞在体内的恶性增殖状态。免疫荧光染色显示黑素瘤细胞A2058-m Cherry可以表达M3、p75NTR、p-CDK1。Western blot显示:在对照组和M3 siRNA处理组中,GAPDH相对表达量分别是1和1.07;M3相对表达分别是1和0.40;p75NTR相对表达分别是1和0.23;p-CDK1相对表达分别是1和0.51。结果表明:M3 siRNA瘤体内注射不但显著抑制M3 mAChR表达水平,而且也能下调下游分子p75NTR和p-CDK1。这些研究结果提示M3-p75NTR-CDK1信号通路在裸鼠体内黑素瘤恶性进展过程中发挥作用。【研究结论】黑素瘤细胞在体内恶性侵袭过程中具有细胞形态转化的潜能。侵袭诱发的状态转化（ITST）可能是体内黑素瘤细胞维持上皮样形态的潜在原因,可以作为研究瘤细胞可塑性的新模型。M3毒蕈碱型胆碱受体在黑素瘤细胞中表达并参与增殖、侵袭和ITST。M3毒蕈碱型胆碱受体与p75NTR相互作用,通过M3-p75NTR-CDK1信号通路调节黑素瘤细胞的生物学功能。抑制M3毒蕈碱型胆碱受体可以降低p75NTR和CDK1表达,显著降低黑素瘤细胞体外增殖和侵袭能力,抑制肿瘤细胞在体内的生长和恶性进展。在裸鼠荷瘤状态下,黑素瘤细胞以上皮样细胞形态为主,与Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等EMT标志物相比,M3毒蕈碱型胆碱受体的表达能更加直接地反映出肿瘤细胞在体内的恶性增殖状态。这些结果提示M3-p75NTR-CDK1信号通路参与黑素瘤恶性进展,M3毒蕈碱型胆碱受体是调节黑素瘤生物学功能的重要靶点和标志物,为黑素瘤的治疗带来新希望。