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【研究背景】肿瘤免疫治疗已在多种肿瘤治疗中取得了突破性的进展,但其疗效在不同患者和肿瘤之间并不统一,且普遍存在应答率低、免疫相关副作用严重等问题。深入研究肿瘤微环境（TME）免疫抑制特性的机制对逆转肿瘤免疫逃逸状态、开发更为有效的免疫治疗靶点至关重要。目前肝癌的治疗方法十分有限,化疗和分子靶向疗法整体治疗效果较差。免疫治疗为肝癌带来了新的策略和希望。现有肝癌免疫治疗虽取得了一定疗效,但仍差强人意。调节性T细胞（Treg）是抑制机体免疫反应的关键细胞亚型。研究表明,在包括肝癌在内的多种肿瘤中,肿瘤组织往往存在大量Treg浸润,且其外周Treg的比例也显著高于健康人。Treg介导的免疫抑制能够阻碍肝脏特异性抗肿瘤免疫反应,在诱导肝癌免疫耐受及促进肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用。在一些临床前肿瘤模型中,清除Treg使肿瘤快速消退并显著逆转了TME的免疫抑制状态,但会引发严重的自身免疫反应。因此,深入研究肝癌中Treg的诱导产生和激活机制,是建立针对Treg免疫治疗策略的关键。生长分化因子15（GDF15）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的成员。GDF15在生理条件下表达水平极低,但在炎症疾病和恶性肿瘤条件下显著上调。近年来,GDF15在诱导恶病质、厌食症和造成体重减轻方面的作用已得到深入阐明。但GDF15作为一种可被炎症诱导的细胞因子,其免疫调节功能尚存争议。【研究目的】为研究肿瘤Treg特异性诱导激活机制,发现针对肿瘤Treg的免疫治疗靶点,本实验通过对肝癌组织浸润Treg比例较高和比例较低的两组肝癌组织样本进行RNAseq高通量测序,鉴定GDF15与肿瘤Treg浸润比例的相关性;通过临床样本检测和TCGA数据库中肝癌样本数据的生物信息学分析,分析肝癌组织中GDF15表达水平与肿瘤Treg浸润比例之间的相关关系;阐明GDF15对Treg诱导分化和功能调节的作用及其分子机制,寻找GDF15在T细胞上的受体并明确其介导下游生物学功能的信号转导途径;研究以GDF15为靶点的肿瘤免疫治疗对小鼠肝癌的治疗作用,明确GDF15作为肿瘤免疫治疗新靶点的应用潜力,以期为针对Treg的肝癌免疫治疗提供新的策略。【研究方法】1.对肝癌组织浸润Treg比例较高和比例较低的肝癌组织样本进行RNA-seq高通量测序,寻找肿瘤Treg特异性诱导激活的相关分子;2.通过对临床肝癌样本GDF15含量、肿瘤、外周血及淋巴结Treg比例的检测,并通过TCGA数据库肝癌样本数据的生物信息学分析证实GDF15与肿瘤Treg浸润比例之间的相关性;3.用CRISPR Cas9系统敲除肝癌细胞系的GDF15基因或给予GDF15体外刺激,通过研究内源性GDF15缺失及外源性GDF15刺激对肿瘤细胞的影响,研究GDF15对肝癌细胞增殖的影响;4.使用GDF15敲除与未敲除的肿瘤细胞构建小鼠原位肝癌模型,研究体内GDF15缺失对小鼠肝癌生长的影响。通过流式质谱（Cytof）研究GDF15缺失对TME中浸润免疫细胞亚群的影响;5.分别研究GDF15对诱导型Treg（Induced Treg,iTreg）和胸腺型Treg（Thymus Treg,tTreg）诱导分化、增殖能力及抑制功能的影响及其分子机制;6.通过IP-MS鉴定T细胞上GDF15的受体,并阐明受体介导GDF15生物学作用的具体分子机制;7.使用GDF15单克隆抗体治疗小鼠原发诱导肝癌,评价GDF15作为肿瘤免疫治疗靶点的有效性,并研究与PD-1单抗联用的效果。【研究结果】1.筛选出了与肝癌Treg相关的GDF15分子;在90例临床肝癌病例的肿瘤组织及其相应外周血和引流淋巴结样本中,证实肝癌组织GDF15的表达量与浸润Treg比例之间的相关性;用多种生物信息学方法在TCGA数据库肝癌样本数据中证实了这种相关性;2.证实GDF15能够诱导外周iTreg的产生、增强nTreg的抑制功能,抑制肝癌TME中的抗肿瘤免疫反应,介导肝癌免疫逃逸;3.鉴定出GDF15在T细胞上的受体CD48,明确GDF15通过与CD48结合抑制了TCR信号通路中ERK/AP-1通路的激活,下调转录因子c-jun/c-fos,减少对STUB1的转录激活作用,降低STUB1的表达,使FOXP3蛋白的积累并对Treg的诱导产生与抑制功能产生促进作用;4.使用单克隆抗体阻断GDF15有效地逆转了肝癌TME的抑制性免疫状态,达到显著的抑瘤效果。GDF15单抗治疗显著改善了荷瘤小鼠的食物摄取,有效减缓了肿瘤引起的体重下降。GDF15单抗与PD-1单抗的联合治疗显示了比任一单独治疗更好的抑瘤效果。【结论】1.GDF15在肝癌中高表达,与肿瘤浸润Treg比例具有相关关系,是肿瘤Treg诱导分化和功能促进的关键分子。GDF15促进肿瘤Treg的产生和功能,增强TME的免疫抑制状态,从而介导肝癌免疫逃逸;2.GDF15通过结合T细胞上的CD48受体以转录后修饰抑制蛋白泛素化降解,促进FOXP3蛋白在细胞内的积累。CD48是目前我们在免疫系统中鉴定出唯一的GDF15受体,介导了GDF15对Treg/T细胞的免疫调节功能。该受体的发现为深入研究GDF15在免疫系统中作用的分子机制提供了可能性;3.GDF15作为特异性针对Treg的肿瘤免疫治疗新靶点,其单克隆抗体能够逆转肝癌TME的免疫抑制状态,对小鼠原发性诱导肝癌具有显著的治疗作用,还能够改善食欲、减缓肿瘤引起的体重下降,抑制恶病质的发生。与PD1单抗联用能够达到更好的治疗效果。