目的:滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl）为百合科黄精属多年生草本植物,是云南省重点打造的大宗药材之一,也是我国重要的药食两用资源之一。丛植菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）是一类广泛定殖于植物根系的互惠共生内生真菌,其在促进药用植物对矿质元素吸收、生物量增加、代谢产物积累、胁迫抗性增强等方面发挥着重要作用。磷素作为植物生长发育过程中的大量元素,其在土壤中的有效水平直接很大程度上影响着药用植物的生物量和功效成分积累。本论文拟以AMF为处理手段,将不同的AMF菌剂接种在滇黄精幼苗根部,在不同有效磷水平处理下,考察AMF对滇黄精生长、主要功效成分积累的影响及调控机制。本研究对明确AMF作用机制,实施滇黄精生态种植、提高质量和产量具有重要的理论和实践意义。方法:1.试验设计及生理生化指标测定以低磷（LP,10 mg/kg）、正常磷（NP,50mg/kg）水平和AMF菌剂（AMF1:根内球囊霉,Glomus intraradices;AMF2:幼套球囊霉,G.etunicatum;AMF3:摩西球囊霉,G.mosseae;AMFs:G.intraradices+G.etunicatum+G.mosseae）为变量进行交互处理,共设LP＿AMF1、LP＿AMF2、LP＿AMF3、LP＿AMFs、NP＿AMF1、NP＿AMF2、NP＿AMF3、NP＿AMFs 8个处理组及LP＿Non-AMF阴性对照组和NP＿Non-AMF不接菌空白组。通过测定滇黄精生物量、多糖、多糖中单糖组份、甾体皂苷等功效成分含量,明确磷和AMF交互处理对滇黄精生长及功效成分积累的影响。通过测定磷吸收效率和转移因子,多糖、甾体皂苷合成通路关键酶基因表达变化,初步揭示AMF调控机制。滇黄精生物量的测定包括总鲜重、块茎鲜重、根重、根长、株高。总多糖和小分子总糖测定采用硫酸苯酚法,还原糖测定采用DNS法。滇黄精多糖中单糖组成的测定采用液相色谱串联质谱法。栽培基质中磷含量的测定采用Na HCO3浸提—钼锑抗比色法以及钼蓝法。滇黄精植株中磷含量的测定采用钼蓝法。2.转录组测序分析根据生理生化指标测定结果,选取NP＿AMF1、LP＿AMF1 2个处理组,LP＿Non-AMF阴性对照组和NP＿Non-AMF空白组新鲜滇黄精根样送生物公司进行转录组测序分析,对转录组质量进行评价,绘制甾体皂苷生物合成关键酶基因差异表达热图。3.目标甾体皂苷合成关键酶基因的筛选、生物信息学、组织表达特性分析及异源表达载体构建根据转录组结果,筛选出显著差异表达的甾体皂苷合成关键酶基因作为目标基因进行深入研究。生物信息分析为利用各种在线软件对其等电点、分子量、亲属性等进行预测;利用DNAMAN、MEG.6.0等软件进行氨基酸序列比对和系统发育树构建;利用Hem I 1.0软件绘制甾体皂苷生物合成关键酶基因差异表达热图。组织表达特性分析采用实时荧光定量2-△△Ct法。同时通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行异源表达,获取目标蛋白,拟进一步研究蛋白作用机制。结果:1.在正常磷或低磷水平条件下,栽培处理6个月后,滇黄精幼苗AMF定殖率均达到60%,不同处理组的定殖率范围为:60.05%～75.06%。接种不同AMF菌剂均可以促进滇黄精总鲜重、块茎鲜重、须根鲜重、株高、根长的增加。在正常磷和低磷水平下,根内球囊霉（AMF1）对总鲜重的增加最为显著,促进率分别可达104.46%、127.07%,其次为幼套球囊霉（AMF2）,促进率分别可达23.51%、65.67%。AMF的定殖对块茎鲜重、须根鲜重、株高和根长的增长均有不同程度的促进作用。此外,在低磷和正常磷处理条件下,AMF的定殖可以显著提高滇黄精对磷素的吸收效率。2.AMF的定殖可以促进滇黄精总多糖含量的增加,尤其是在低磷胁迫条件下,促进效果更加显著。在正常磷水平下,组合菌（AMFs）对总多糖含量增加促进效果最为显著,促进增长率为90.41%,其次为幼套球囊霉（AMF2）,促进增长率为59.65%;在低磷水平下,根内球囊霉（AMF1）、组合菌（AMFs）对总多糖含量增加促进效果最为显著,促进增长率分别为176.38%、108.98%。对多糖中糖类组成成分分析发现,多糖中含量较高的依次是蔗糖、果糖、葡萄糖、肌醇;在正常磷水平下,AMF可以显著促进蔗糖和果糖的积累,其中AMF2促进增长率最高,对蔗糖、果糖和肌醇的促进增长率分别为143.36%、61.39%、79.21%;在低磷条件下,AMF的定殖对果糖和葡萄糖的积累有着显著影响,其中AMF2对果糖的促进增长率为180.06%,AMF1对葡萄糖促进增长率为79.10%。在正常或低磷水平条件下,AMF1、AMF2对薯蓣皂苷元含量的积累具有显著促进作用,促进率分别为29.25%、146.74%、58.28%、140.57%。3.NP＿AMF1、LP＿AMF1处理组及LP＿Non-AMF阴性对照组和NP＿Non-AMF空白组转录组测序结果显示,Q20、Q30值范围分别为97.70%～98.12%、93.62%～94.37%,表明转录组库质量良好,结果可靠。在相同磷水平条件下,AMF的定殖可诱导更多的基因上调表达。通过GO、KOG、KEGG分析发现,差异基因在细胞组成成分方面主要富集在细胞部分,在分子功能方面主要富集在蛋白质结合和催化活性中心,在生物过程方面主要富集在代谢过程和细胞过程。在KEGG代谢途径分析显示,磷水平和AMF交互处理下差异基因主要富集在核糖体、次级代谢产物生物合成、代谢等途径。甾体皂苷生物合成关键酶基因差异表达热图显示,DXR、DXS、FPS、CAS、SS和SE家族基因响应AMF诱导而上调表达,且在低磷胁迫下效果更加显著。4.选取甾体皂苷合成关键酶基因Pk FPS1、Pk CAS1、Pk SE5、Pk SS1、Pk SS2进行深入研究,结果显示其分属于环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophaophate synthase,FPS）、鲨烯合酶（squalene synthase,SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SE）4个家族,ORF的长度分别为1,050 bp、2,286 bp、1,077 bp、1,230 bp、1,233 bp,编码349 aa、761 aa、358 aa、409 aa、410 aa;等电点和蛋白质分子量分别为6.27/110.02 k Da、5.59/64.06 k Da、7.97/62.41 k Da、6.83/70.22 k Da、6.48/70.30 k Da。q PCR结果显示,5条目标基因在不同组织部位对AMF、低磷诱导的响应不尽相同。正常磷水平处理下,在块茎部位,Pk FPS1、Pk CAS1、Pk SS1、Pk SS2均会响应AMF3诱导显著上调表达,其表达量分别为1.83、3.38、2.39和1.99倍;低磷水平处理下,在须根部位,Pk FPS1、Pk CAS1、Pk SS1、Pk SS2均会响应AMF1诱导显著上调表达,其表达量分别为2.51、1.43、1.84和1.62倍,在块茎部位,Pk FPS1、Pk CAS1、Pk SS1、Pk SS2均会响应AMFs诱导显著上调表达,其表达量分别为1.46、1.51、4.17和5.86倍;正常或低磷水平下,在叶部位,5条基因均会响应AMF1诱导而显著上调表达,且表达量正常磷组高于低磷组,在块茎部位,Pk CAS1、Pk SS1、Pk SS2均会响应AMF3、AMFs诱导上调表达,且Pk SS1、Pk SS2表达量低磷组高于正常磷组,在须根部位,Pk FPS1、Pk CAS1、Pk SS1、Pk SS2均会响应AMF1诱导上调表达,且低磷组表达量均高于正常磷组;横向比较不同组织部位,相同处理条件下,同一基因在叶中表达量最高,块茎次之。5.通过Pk FPS1原核异源表达,获得了目标蛋白,大小为64 k Da,与预测的蛋白分子量相符。在诱导过程中,随着诱导时间的增加,蛋白表达量也随之增加。目的蛋白仅出现在沉淀中,表明该蛋白属于包涵体蛋白。结论:本研究发现,无论在正常还是低磷处理条件下,接种不同AMF菌剂均可以促进滇黄精生物量的提高,尤其是AMF1（根内球囊霉）和AMF2（幼套球囊霉）作用尤为显著。此外,AMF的定殖可以促进滇黄精总多糖、多糖组分中的蔗糖、果糖、葡萄糖、甾体皂苷含量的增加,尤其是在低磷胁迫条件下,促进效果更加显著;横向比较发现,总体上AMF2（幼套球囊霉）对滇黄精功效成分积累的促进作用最为显著。究其作用机制分析发现,有效磷吸收效率的提高是促进滇黄精的生长、生物量增加的主要原因之一;而功效成分生物合成通路关键酶基因差异表达则是AMF调控多糖、甾体皂苷积累的重要环节。本实验为进一步深入研究滇黄精多糖、甾体皂苷等功效成分积累对AMF诱导的响应机制奠定了基础。