缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型,在世界范围内,疾病负担、伤害及危险因素评估显示,脑梗死是至死的第二大常见原因,致残的第三大常见原因。脑梗死的发病率、病死率、致残率和复发率成逐年升高的趋势,其病后恢复时间长,预后不理想等特点,给社会和家庭带来沉重的负担。脑梗死发生时,梗死核心区,出现明显氧含量减少以及神经组织迅速坏死,而梗死周边区表现出含氧量和灌注适度减少,这种损伤是可以被挽救的。因为在此区存在梗死的风险,但尚未形成不可逆损伤。因此,缺血半暗带,是目前脑卒中血管再通和神经保护治疗的重点。静脉溶栓被认为是急性脑梗死最有效治疗方法,但是由于严格的治疗时间窗和治疗后出血并发症,脑梗死后静脉溶栓率并不高。因此,寻找新的药物作用靶点,为脑梗死治疗方案提供可靠依据显得尤为重要。血脑屏障(blood brain barrier,BBB)是存在于大脑血液循环与神经组织之间的特殊屏障,它的主要功能是维持脑组织稳态,调节脑内物质交换平衡,保护脑组织免受侵害。血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞、内皮细胞间紧密连接蛋白、毛细血管基膜、周围星型胶质细胞和周细胞构成,每种构成血脑屏障的细胞在维持BBB完整性中,都起不可缺少的作用,当一种细胞损伤时,脑屏障作用被打破,引发神经炎症、神经退行性变等一系列严重后果。缺血性脑卒中的病理生理过程涉及BBB功能紊乱,细胞初级和次级破坏、死亡。由于BBB在脑血管病发病机制中起核心作用,所以BBB被认为是脑梗死治疗的新靶点,血脑屏障研究为临床新药研究提供依据。核转录因子Nrf-2(NFE2-related factor 2,Nrf-2)通过与细胞压力信号结合,参与转录过程,调节下游多种解毒酶和抗氧化酶的表达。Nrf-2/HO-1(heme oxygenase 1,HO-1)信号通路是最重要的一种细胞防御机制,Nrf-2作为脑保护因子,对脑梗死后炎症反应及氧化应激反应调节起至关重要的作用。脑梗死后,细胞内出现大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)参与氧化应激反应和细胞毒性物质的释放。然而,脑梗死后,使用药物激活nrf-2/ho-1信号通路,会启动细胞内抗氧化应激反应,因此nrf-2信号通路具有细胞保护作用。研究表明,实验性脑损伤模型中,使用nrf-2激动剂萝卜硫素激活nrf-2信号通路,血脑屏障完整性和稳定性都有所提升。因此,nrf-2信号通路和下游的保护性因子是脑梗死血脑屏障治疗的关键靶点。益母草碱(leonurine,leoc14h21n3o5)是益母草的有效成分,具有抗氧化、抗血小板聚集、促进子宫收缩、活血化瘀等多种生物学作用。leo通过阻止钙离子内流,有效的抑制血管平滑肌收缩。在大鼠大脑中动脉模型中,益母草碱通过保护线粒体功能,实现脑保护作用。体外实验证实益母草通过抗氧化应激反应,在心肌缺血后发挥保护作用。然而并没有研究显示益母草碱是否在稳定血脑屏障,维持其完整性方面具有贡献,本研究主要探讨益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用及相关机制。本研究选用雄性cd-1小鼠和nrf-2基因小鼠为研究对象,应用改良longa线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型(permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pmcao)模型。在小鼠永久性大脑中动脉闭塞所致的实验性脑梗死模型中应用益母草碱进行干预,通过对脑梗死体积、脑组织含水量及神经功能缺损评估,观察益母草碱对实验性脑梗死小鼠脑保护作用;通过观察伊文思蓝(evansblue,eb)的渗出情况,紧密连接蛋白相关指标基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9,mmp-9)和claudin-5表达,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)的表达,星型胶质细胞活化标志物神经胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)的表达和血脑屏障超微结构变化,评估益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用。通过观察应用益母草碱后,nrf-2/ho1信号通路相关因子表达的变化,nrf-2基因敲除小鼠血脑屏障状态,探讨益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用相关机制。本研究分为三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分益母草碱对实验性脑梗死小鼠脑保护作用目的:观察实验性脑梗死小鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积。研究益母草碱对实验性脑梗死小鼠脑保护作用。方法:选用成年雄性cd-1小鼠作为研究对象,采用longa改良线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型。随机将cd-1小鼠分为6组:sham组:小鼠假手术后2h腹腔注射等量生理盐水;vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;leo25组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱2.5mg/kg;leo50组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱5.0mg/kg;leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg;leo150组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腔注射益母草碱15.0mg/kg;在永久性大脑中动脉闭塞的24h后,通过longa改良评分法评价神经功能缺损,干湿重法测定脑组织含水量,2%2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色法测定脑梗死体积,观察益母草碱的神经保护作用。结果:1sham组无神经功能缺损,神经功能缺损评分为0分;vehicle组在24h神经功能缺损评分较严重;与vehicle组相比,leo25组在24h后神经功能缺损评分没有明显降低,差异无统计学意义(p>0.05)。与vehicle组相比,leo50、leo100和leo150组在24h神经功能缺损评分明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。2leo25和leo50组的脑组织含水量在24h与vehicle组相比均没有明显降低,差异无统计学意义(p>0.05),leo100和leo150组的脑组织含水量在24h与vehicle组相比均明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。3leo25组的脑梗死体积在24h与vehicle组相比没有显著降低,差异无统计学意义(p>0.05),leo50、leo100和leo150组的脑梗死体积在24h分别与vehicle组相比均明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:缺血后2h腹腔注射益母草碱对实验性脑梗死小鼠具有脑保护作用,能够改善脑梗死后的神经功能缺损,降低脑组织含水量,减小脑梗死体积。第二部分益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用目的:通过观察伊文思蓝的渗出情况,紧密连接蛋白相关指标mmp-9和claudin-5的表达,血管内皮生长因子vegf的表达,星型胶质细胞活化标志物gfap的表达和血脑屏障超微结构变化,评估益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用。方法:选用成年雄性cd-1小鼠作为研究对象,采用longa改良线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型。随机将cd-1小鼠分为6组:sham组:小鼠假手术后2h腹腔注射等量生理盐水;vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;leo25组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱2.5mg/kg;leo50组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱5.0mg/kg;leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg;leo150组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腔注射益母草碱15.0mg/kg;在永久性大脑中动脉闭塞的24h后,各组取材前进行神经功能缺损评分,分别于缺血后24h,观察伊文思蓝的渗出情况。随后实验中,随机将cd-1小鼠分为3组:sham组:小鼠假手术后2h腹腔注射等量生理盐水;vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg。各组取材前进行神经功能缺损评分,分别于缺血后24h,应用免疫组化,western-blot和qrt-pcr方法检测缺血脑组织中mmp-9、claudin-5、vegf和gfap表达,应用电镜观察血脑屏障超微结构变化。结果:脑梗死后24h,缺血脑组织出现血脑屏障渗透性增加,mmp-9表达升高,claudin-5、vegf和gfap表达降低,血脑屏障内皮细胞胞质水肿,吞饮小泡增多。益母草碱降低血脑屏障渗透性,降低mmp-9表达,升高claudin-5、vegf和gfap表达,减轻内皮细胞水肿,减少吞饮小泡。1sham组无evansblue渗出,血脑屏障完整;vehicle组在24h后,evansblue渗出较严重;leo25、leo50、leo100和leo150组在24h与vehicle组相比,evansblue渗出明显减少,leo能够维持血脑屏障的完整性。据此,我们从神经功能缺损评分,脑水肿,脑梗死体积和伊文思蓝渗出四方面观察,发现益母草碱以高剂量(15.0mg/kg)和中剂量(10.0mg/kg)给药时可以发挥较好的治疗效果。因此,我们后续的研究主要集中在益母草碱的中剂量(10.0mg/kg)。2通过免疫组化染色发现,与vehicle组相比,leo100组的mmp-9阳性细胞表达在24h降低,claudin-5、vegf和gfap阳性细胞表达在24h升高。3通过western-blot发现,与vehicle组相比,leo100组mmp-9蛋白表达水平在24h显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05),claudin-5、vegf和gfap蛋白表达水平在24h显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。4通过qrt-pcr发现,与vehicle组相比,leo100组mmp-9的mrna表达水平在24h显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05),claudin-5、vegf和gfap的mrna表达水平在24h显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。5sham组内皮细胞结构正常,有少量吞饮小泡,vehicle组在24h后,血脑屏障内皮细胞胞质水肿,吞饮小泡增多,与vehicle组相比,leo100组的内皮细胞水肿减轻,吞饮小泡减少。结论:实验性脑梗死后24h,缺血脑组织的血脑屏障渗透性增加,完整性破坏。益母草碱能够明显减低血脑屏障渗透性,维持血脑屏障完整性。使用益母草碱后,缺血脑组织mmp-9表达下降和claudin-5、vegf和gfap表达升高,改善血脑屏障超微机构。益母草碱能够抑制紧密连接蛋白的降解,减少紧密连接蛋白重新分布,启动梗死后血管新生,保护内皮细胞形态,从而稳定内皮细胞功能,稳定星型胶质细胞膜骨架,从而稳定bbb结构,维持血脑屏障功能,增加血脑屏障稳定性。而益母草碱维持血脑屏障完整性,增加血脑屏障的稳定性和对实验性脑梗死小鼠的脑保护作用是一致的,故我们推测益母草碱可能通过保护血脑屏障发挥其脑保护作用。第三部分益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用机制研究目的:观察实验性脑梗死后,nrf-2/ho-1信号通路相关因子表达的变化,观察nrf-2基因小鼠脑梗死后血脑屏障相关蛋白的表达,研究益母草碱对实验性脑梗死小鼠血脑屏障保护作用的相关机制。方法:选用成年雄性cd-1小鼠和nrf-2基因小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型。随机将cd-1小鼠分为3组:sham组:小鼠假手术后2h腹腔注射等量生理盐水;vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg。各组取材前进行神经功能缺损评分,分别于缺血后24h,应用免疫组化,western-blot和qrt-pcr方法检测缺血脑组织中nrf-2和ho-1蛋白表达和mrna水平的变化表达。随机将nrf-2基因小鼠分为4组:nrf-2+/+vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;nrf-2+/+leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg;nrf-2-/-vehicle组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射等量生理盐水;nrf-2-/-leo100组:小鼠大脑中动脉闭塞后2h腹腔注射益母草碱10.0mg/kg。分别于缺血后24h,应用western-blot和qrt-pcr方法检测缺血脑组织中mmp-9、claudin-5、vegf和gfap蛋白表达和mrna水平的变化表达。结果:脑梗死后24h,缺血脑组织中nrf-2和ho-1表达均降低,益母草碱(10.0mg/kg)升高nrf-2和ho-1表达。在nrf-2基因敲除小鼠缺血脑组织中,益母草碱降低mmp-9表达,升高claudin-5、vegf和gfap表达的能力被阻滞。1通过免疫组化染色发现,与vehicle组相比,leo100组的nrf-2和ho-1阳性细胞表达在24h升高。2通过western-blot发现,与vehicle组相比,leo100组nrf-2和ho-1蛋白表达水平在24h显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。3通过qrt-pcr发现,与vehicle组相比,leo100组nrf-2和ho-1的mrna表达水平在24h显著升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。4通过western-blot发现,与nrf2-/-vehicle组相比,nrf2-/-leo100组mmp-9蛋白表达水平在24h降低不明显,差异没有统计学意义(p>0.05),claudin-5、vegf和gfap蛋白表达水平在24h升高不明显,差异没有统计学意义(p>0.05)。5通过qrt-pcr发现,与nrf2-/-vehicle组相比,nrf2-/-leo100组mmp-9的mrna表达水平在24h降低不明显,差异没有统计学意义(p>0.05),claudin-5、vegf和gfap的mrna表达水平在24h升高不明显,差异没有统计学意义(p>0.05)。结论:实验性脑梗死后,益母草碱对缺血脑组织中nrf-2/ho-1信号通路具有激活作用,而在Nrf-2基因敲除小鼠缺血脑组织中,益母草碱保护血脑屏障的作用被阻滞。这提示益母草碱有可能通过激活Nrf-2/HO-1信号通路发挥血脑屏障保护作用,从而实现脑保护作用。