研究背景：　　先天性心脏病(Congenital heart disease，CHD）是人类最常见的出生缺陷之一，也是婴儿期非感染死亡的首位病因，其发病率大约为所有活产婴儿的1%。CHD的发生主要是源于胚胎期异常的心脏发育，而胚胎期心脏发育是一个极其复杂的过程，受信号通路、转录因子、表观遗传等因素形成的整个心脏发育网络调控，其中任何组份的基因出现突变都有可能导致CHD的发生。其致病机制至今不十分清楚。室间隔缺损（Ventricular septal defect，VSD）是最常见的一种CHD类型，约占所有CHD的30%。目前对VSD的分子致病机制研究甚少，目前已报道VSD的致病基因主要有GATA4、GATA6、NKX2.5、TXB1、TBX5等。　　EVC（Ellis-van Creveld）作为Hedgehog（Hh）信号通路的正向调节蛋白，参与胚胎发育过程。EVC基因突变可导致EVC综合征（Ellis-van Creveld Syndrome）。EVC综合征是一种常染色体隐性遗传病，其临床表现以软骨发育不良、多指（趾）、CHD和外胚层发育不良为主。大约有60%EVC综合征患者具有CHD表型，其中又以房室间隔缺损(atrioventricular septal defects，AVSD)、房间隔缺损（atrial septal defect，ASD）和VSD多见。关于EVC基因变异的研究主要集中在EVC综合征家系的研究及其对软骨发育的影响，对VSD患者中EVC基因变异情况及其相关致病机制的研究未见报道。　　第一部分 VSD患者的EVC基因遗传分析　　目的：　　了解中国汉族VSD患者中EVC基因变异情况，并探讨EVC基因变异与VSD发生的遗传相关性。　　方法：　　选取南昌大学第二附属医院住院的汉族非综合征VSD患者65例以及210例相同遗传背景正常健康人群作为研究对象，采用DNA直接测序法对EVC基因所有外显子，外显子和内含子交界区序列，进行双向测序分析。以期发现新的致病基因突变位点或单核苷酸多态性（ single-nucleotide polymorphisms,SNPs）。严格遵循医学伦理准则，本课题通过医院医学伦理会，患者知情同意。　　1.发现的基因变异与dbSNP数据库信息比对确认，同时根据正常对照组的基因变异频率，以鉴别基因多态性或基因突变。并运用PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster软件对VSD组和对照组之间有频率差异的SNP位点及突变位点进行基因变异功能预测，选取致病可能性大的突变位点进行功能研究。　　2.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析，以p<0.05(或者运用Bonferroni校正法校正后的p值)为差异有统计学意义。根据 Hardy-Weinberg平衡定律检验SNP基因型的遗传平衡状态，运用卡方检验对SNP的基因型和等位基因频率进行统计分析。SNP位点与VSD的相对危险度用OR(odd ratio)值以及95%CI(Confidence Interval)表示。　　结果：　　1.通过候选基因EVC测序筛查，在VSD患者中检测到杂合错义突变一个，突变位于EVC基因3号外显子，为编码区第343位碱基C转换为碱基G，导致第115位氨基酸由亮氨酸变为缬氨酸，即c.343C>G(p.L115V)，该位点在本研究的其他VSD患者和对照组中均未检测出。　　2.检测到EVC的SNP位点11个，分别为：c.221A>C(p.Q74P)，c.772T>C(p.Y258H)，c.969T>C(p.N323N)，c.1026G>C(p.L342L)，c.1068A>G(p.L356L)，c.1320T>A(p.F440L)，c.1333A>C(p.K445Q)，c.1346C>A(p.T449K)，c.1727G>A(p.R576Q)，c.1854C>T(p.G618G)；其中c.1026G>C，c.1320T>A，c.1333A>C和c.1346C>A四个SNP位点由于对照组Hardy-Weinberg平衡检验p<0.05，即基因频率偏离了遗传平衡法则，故后续分析将该四个位点排除在外。其他7个SNP位点经纯合，杂合，显性，隐性和等位基因五种遗传模型统计分析结果显示：SNP c.221A>C的C等位基因与VSD患病风险呈负相关（OR=0.543，95%CI=0.300-0.981）；携带c.1854C>T位点CC基因型的VSD发病风险为TT基因型的2.246倍（95%CI=1.009-4.998）， C等位基因为VSD的风险等位基因（OR=1.523，95%CI=1.019-2.278），而仅c.1727G>A位点在Bonferroni校正后仍然与VSD的发病呈明显正相关（ p<0.007），即携带 GA基因型者患VSD的风险为 GG基因型的4.411倍（95%CI=2.047-9.506），同时在显性模式中，携带A等位基因者患VSD风险为野生型者的4.2倍（95%CI=1.982-8.901），c.1727G>A中的A等位基因是VSD的风险等位基因（OR=2.039，95%CI=1.301-3.195）。其余多态性位点在五种模型中的分布差异均无统计学意义。　　3.基因变异功能预测结果：c.343C>G突变位点和SNP c.1727G>A位点在PolyPhen-2和MutationTaster软件中均显示致病性变异可能；其中c.343C>G可能是致病性突变，而c.1727G>A则可能引起剪切位点改变；c.221A>C SNP位点仅在MutationTaster软件中预测结果显示为可能改变剪切位点，c.1854C>T位点在三个软件中均显示为良性变异。　　结论：　　1.首次报道EVC基因多态性c.1727G>A增加国人汉族VSD易感性；　　2.c.343C>G可能是EVC基因中的致病性突变。　　第二部分 EVC基因L115V突变参与VSD的致病机制探讨　　目的：　　在细胞水平探讨EVC-L115V突变对 Hedgehog信号通路的影响，探讨EVC-L115V突变参与VSD可能的致病机制。　　方法：　　构建EVC的野生型和L115V突变型腺病毒，分别感染小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株（NIH3T3），运用Hedgehog信号通路激动剂SAG（Smo agonist）激活通路，将实验分成四组：EVC-WT（wild type），EVC-L115V，EVC-WT+SAG，EVC-L115V+SAG，进行如下实验：　　1.观察EVC-L115V突变对细胞增殖的影响：运用细胞免疫荧光技术观察不同分组细胞中的增殖性抗原Ki67的表达情况，荧光显微镜计数高倍镜视野下ki67阳性数与细胞总数，计算ki67细胞阳性率；采用EdU法进一步检测细胞的增殖率，利用荧光显微镜观察高倍镜视野下EdU阳性细胞数占细胞总数的比例，计算细胞增殖率；Western Blot检测不同分组细胞中的细胞周期蛋白CyclinD1的表达。　　2.探讨EVC-L115V突变对细胞凋亡的影响：运用H2O2进行凋亡诱导，运用Western Blot分别检测使用H2O2和未使用H2O2的不同实验分组中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达，以Bcl-2/Bax的蛋白表达比值作为细胞抗凋亡能力的检测指标；Tunel法观察使用H2O2诱导凋亡后的不同实验分组中的凋亡细胞比例。　　3.检测EVC-L115V突变对Hedgehog信号通路的影响：采用Western Blot检测四个实验分组的NIH3T3细胞中Gli1、Foxf1a的蛋白表达情况；构建Gli1荧光素酶报告质粒，以海肾荧光报告质粒作为内参，选用Lipofectamine LTX进行质粒转染，运用双荧光素酶报告实验检测EVC-L115V过表达后对Gli1的转录激活能力的影响；实时荧光定量PCR（Real-time PCR)检测上述分组中Foxf1a的mRNA水平；构建Flag-Gli2质粒，转染进入NIH3T3细胞中，Western Blot检测Gli2抑制形式Gli2R和全长形式Gli2FUL的表达情况；采用免疫共沉淀技术检测EVC-L115V突变对EVC与Smo蛋白结合的影响。　　结果：　　1.EVC-L115V突变可明显降低NIH3T3细胞增殖水平：在NIH3T3细胞中，当Hedgehog通路激活时，Ki67免疫荧光实验显示，与WT组相比，EVC-L115V组增殖阳性细胞数明显减少（23±1.3%vs.30.4±1.8%，L115V vs.WT，p<0.05），EdU细胞增殖实验S期细胞百分比显著下降（12.5±0.7%vs.15.6±0.4%，L115V vs.WT，p<0.05）。EVC-L115V组较EVC-WT组细胞周期蛋白CyclinD1表达明显下调（p<0.05）。　　2.EVC-L115V突变增加细胞凋亡：Western Blot结果显示，给予SAG处理后，NIH3T3细胞中Bcl-2与Bax表达无差异；而给予H2O2诱导后，SAG处理组中，与EVC野生型组比，EVC-L115V突变组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，而促凋亡蛋白Bax表达上调，Bcl2/Bax蛋白表达比值明显下降；TUNEL结果发现，给予 H2O2诱导后，突变EVC-L115V可明显增加细胞凋亡（15.0±0.7% vs.7.5±0.6%，L115V vs.WT，p<0.01）；SAG未处理的两组之间无差异。　　3.EVC-L115V降低Hedgehog信号通路活性：SAG处理后，与EVC野生型组比，EVC-L115V组的Gli1蛋白表达下调，Gli1转录活性下降；Foxf1a的mRNA水平明显下调，Foxf1a蛋白表达无差异；Gli2剪切后的抑制形式Gli2R与全长形式Gli2FUL的比例增加；EVC-L115V突变后与Smo蛋白的结合明显减少。　　结论：　　突变EVC-L115V可通过下调Hedgehog通路活性，降低细胞抗凋亡能力和细胞增殖水平，这可能是该突变参与室间隔缺损的致病机制之一。　　研究背景　　先天性心脏病(Congenital heart disease，CHD）是人类最常见的出生缺陷之一，也是婴儿期非感染死亡的首位病因，其发病率大约为所有活产婴儿的1%。CHD的发生主要是源于胚胎期异常的心脏发育，而胚胎期心脏发育是一个极其复杂的过程，受信号通路、转录因子、表观遗传等因素形成的整个心脏发育网络调控，其中任何组份的基因出现突变都有可能导致CHD的发生。其致病机制至今不十分清楚。室间隔缺损（Ventricular septal defect，VSD）是最常见的一种CHD类型，约占所有CHD的30%。目前对VSD的分子致病机制研究甚少，目前已报道VSD的致病基因主要有GATA4、GATA6、NKX2.5、TXB1、TBX5等。　　EVC（Ellis-van Creveld）作为Hedgehog（Hh）信号通路的正向调节蛋白，参与胚胎发育过程。EVC基因突变可导致 EVC综合征（Ellis-van Creveld Syndrome）。EVC综合征是一种常染色体隐性遗传病，其临床表现以软骨发育不良、多指（趾）、CHD和外胚层发育不良为主。大约有60%EVC综合征患者具有CHD表型，其中又以房室间隔缺损(atrioventricular septal defects，AVSD)、房间隔缺损（atrial septal defect，ASD）和VSD多见。关于EVC基因变异的研究主要集中在EVC综合征家系的研究及其对软骨发育的影响，对VSD患者中EVC基因变异情况及其相关致病机制的研究未见报道。　　第一部分 VSD患者的EVC基因遗传分析　　目的：　　了解中国汉族VSD患者中EVC基因变异情况，并探讨EVC基因变异与VSD发生的遗传相关性。　　方法：　　选取南昌大学第二附属医院住院的汉族非综合征VSD患者65例以及210例相同遗传背景正常健康人群作为研究对象，采用DNA直接测序法对EVC基因所有外显子，外显子和内含子交界区序列，进行双向测序分析。以期发现新的致病基因突变位点或单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms,SNPs）。严格遵循医学伦理准则，本课题通过医院医学伦理会，患者知情同意。　　1.发现的基因变异与dbSNP数据库信息比对确认，同时根据正常对照组的基因变异频率，以鉴别基因多态性或基因突变。并运用PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster软件对VSD组和对照组之间有频率差异的SNP位点及突变位点进行基因变异功能预测，选取致病可能性大的突变位点进行功能研究。　　2.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析，以p<0.05(或者运用Bonferroni校正法校正后的p值)为差异有统计学意义。根据Hardy-Weinberg平衡定律检验SNP基因型的遗传平衡状态，运用卡方检验对SNP的基因型和等位基因频率进行统计分析。SNP位点与VSD的相对危险度用OR(odd ratio)值以及95%CI(Confidence Interval)表示。　　结果：　　1.通过候选基因EVC测序筛查，在VSD患者中检测到杂合错义突变一个，突变位于EVC基因3号外显子，为编码区第343位碱基C转换为碱基G，导致第115位氨基酸由亮氨酸变为缬氨酸，即c.343C>G(p.L115V)，该位点在本研究的其他VSD患者和对照组中均未检测出。　　2.检测到EVC的SNP位点11个，分别为：c.221A>C(p.Q74P)，c.772T>C(p.Y258H)，c.969T>C(p.N323N)，c.1026G>C(p.L342L)，c.1068A>G(p.L356L)，c.1320T>A(p.F440L)，c.1333A>C(p.K445Q)，c.1346C>A(p.T449K)，c.1727G>A(p.R576Q)，c.1854C>T(p.G618G)；其中c.1026G>C，c.1320T>A，c.1333A>C和c.1346C>A四个SNP位点由于对照组Hardy-Weinberg平衡检验p<0.05，即基因频率偏离了遗传平衡法则，故后续分析将该四个位点排除在外。其他7个SNP位点经纯合，杂合，显性，隐性和等位基因五种遗传模型统计分析结果显示：SNP c.221A>C的C等位基因与VSD患病风险呈负相关（OR=0.543，95%CI=0.300-0.981）；携带c.1854C>T位点CC基因型的VSD发病风险为TT基因型的2.246倍（95%CI=1.009-4.998），C等位基因为VSD的风险等位基因（OR=1.523，95%CI=1.019-2.278），而仅c.1727G>A位点在Bonferroni校正后仍然与VSD的发病呈明显正相关（p<0.007），即携带 GA基因型者患 VSD的风险为 GG基因型的4.411倍（95%CI=2.047-9.506），同时在显性模式中，携带A等位基因者患VSD风险为野生型者的4.2倍（95%CI=1.982-8.901），c.1727G>A中的A等位基因是VSD的风险等位基因（OR=2.039，95%CI=1.301-3.195）。其余多态性位点在五种模型中的分布差异均无统计学意义。　　3.基因变异功能预测结果：c.343C>G突变位点和SNP c.1727G>A位点在PolyPhen-2和MutationTaster软件中均显示致病性变异可能；其中c.343C>G可能是致病性突变，而c.1727G>A则可能引起剪切位点改变；c.221A>C SNP位点仅在MutationTaster软件中预测结果显示为可能改变剪切位点，c.1854C>T位点在三个软件中均显示为良性变异。　　结论：　　1.首次报道EVC基因多态性c.1727G>A增加国人汉族VSD易感性；　　2. c.343C>G可能是EVC基因中的致病性突变。　　第二部分 EVC基因L115V突变参与VSD的致病机制探讨　　目的：　　在细胞水平探讨EVC-L115V突变对 Hedgehog信号通路的影响，探讨EVC-L115V突变参与VSD可能的致病机制。　　方法：　　构建EVC的野生型和L115V突变型腺病毒，分别感染小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株（NIH3T3），运用Hedgehog信号通路激动剂SAG（Smo agonist）激活通路，将实验分成四组：EVC-WT（wild type），EVC-L115V，EVC-WT+SAG，EVC-L115V+SAG，进行如下实验：　　1.观察EVC-L115V突变对细胞增殖的影响：运用细胞免疫荧光技术观察不同分组细胞中的增殖性抗原Ki67的表达情况，荧光显微镜计数高倍镜视野下ki67阳性数与细胞总数，计算ki67细胞阳性率；采用EdU法进一步检测细胞的增殖率，利用荧光显微镜观察高倍镜视野下EdU阳性细胞数占细胞总数的比例，计算细胞增殖率；Western Blot检测不同分组细胞中的细胞周期蛋白CyclinD1的表达。　　2.探讨EVC-L115V突变对细胞凋亡的影响：运用H2O2进行凋亡诱导，运用Western Blot分别检测使用H2O2和未使用H2O2的不同实验分组中的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达，以Bcl-2/Bax的蛋白表达比值作为细胞抗凋亡能力的检测指标；Tunel法观察使用H2O2诱导凋亡后的不同实验分组中的凋亡细胞比例。　　3.检测EVC-L115V突变对Hedgehog信号通路的影响：采用Western Blot检测四个实验分组的NIH3T3细胞中Gli1、Foxf1a的蛋白表达情况；构建Gli1荧光素酶报告质粒，以海肾荧光报告质粒作为内参，选用Lipofectamine LTX进行质粒转染，运用双荧光素酶报告实验检测EVC-L115V过表达后对Gli1的转录激活能力的影响；实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测上述分组中Foxf1a的mRNA水平；构建Flag-Gli2质粒，转染进入NIH3T3细胞中，Western Blot检测Gli2抑制形式Gli2R和全长形式Gli2FUL的表达情况；采用免疫共沉淀技术检测EVC-L115V突变对EVC与Smo蛋白结合的影响。　　结果：　　1.EVC-L115V突变可明显降低NIH3T3细胞增殖水平：在NIH3T3细胞中，当Hedgehog通路激活时，Ki67免疫荧光实验显示，与WT组相比，EVC-L115V组增殖阳性细胞数明显减少（23±1.3%vs.30.4±1.8%，L115V vs.WT，p<0.05），EdU细胞增殖实验S期细胞百分比显著下降（12.5±0.7%vs.15.6±0.4%，L115V vs.WT，p<0.05）。EVC-L115V组较EVC-WT组细胞周期蛋白CyclinD1表达明显下调（p<0.05）。　　2. EVC-L115V突变增加细胞凋亡：Western Blot结果显示，给予SAG处理后，NIH3T3细胞中Bcl-2与Bax表达无差异；而给予H2O2诱导后，SAG处理组中，与EVC野生型组比，EVC-L115V突变组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，而促凋亡蛋白Bax表达上调，Bcl2/Bax蛋白表达比值明显下降；TUNEL结果发现，给予H2O2诱导后，突变EVC-L115V可明显增加细胞凋亡（15.0±0.7% vs.7.5±0.6%，L115V vs.WT，p<0.01）；SAG未处理的两组之间无差异。　　3.EVC-L115V降低Hedgehog信号通路活性：SAG处理后，与EVC野生型组比，EVC-L115V组的Gli1蛋白表达下调，Gli1转录活性下降；Foxf1a的mRNA水平明显下调，Foxf1a蛋白表达无差异；Gli2剪切后的抑制形式Gli2R与全长形式Gli2FUL的比例增加；EVC-L115V突变后与Smo蛋白的结合明显减少。　　结论：　　突变EVC-L115V可通过下调Hedgehog通路活性，降低细胞抗凋亡能力和细胞增殖水平，这可能是该突变参与室间隔缺损的致病机制之一。