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目的： CRISPR/Cas9技术可快速简便的进行基因敲除，已成功应用于多个领域，但是由于大多数原核生物缺乏非同源末端连接系统，CRISPR/Cas9技术的基因编辑会导致细菌死亡，限制了其在原核生物中的应用。本研究旨在构建可定点敲除基因且能广宿主表达的CRISPR/Cas9敲除质粒，并构建可修复断裂DNA的非同源末端连接质粒，寻求一种一步敲除原核生物基因的方法，简化原核生物基因组的基因编辑操作，便于进一步研究原核生物各基因的功能。 方法： 1.构建敲除质粒并验证其敲除能力：利用酶切连接原理，构建敲除重组质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA。PAGE和Western blot实验检测敲除质粒的Cas9蛋白表达情况。再将重组质粒导入鲍曼不动杆菌和E. coli DH5α，验证重组质粒对基因组和质粒的编辑能力。 2.构建非同源末端连接质粒并验证其修复能力：利用重叠延伸PCR技术，分别为Ku基因和LigD基因加上启动子和终止序列。利用酶切连接的方式将Ku和LigD连入质粒中，并把质粒的抗性基因换为亚碲酸盐抗性基因。考马斯亮蓝染液染色检测修复质粒的Ku蛋白、LigD蛋白表达情况。再利用酶切pUC19验证其修复功能。 结果： 1.构建敲除质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA：PCR鉴定及测序鉴定都表明成功构建了敲除质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA。 2.重组质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA的Cas9蛋白表达：在PAGE及蛋白印迹实验中，分别在90kDa～130kDa和130kDa～175kDa两处检测到Cas9蛋白的条带；Cas9蛋白在不同宿主E. coli DH5α、E. coli BL21、鲍曼不动杆菌ATCC17978中都能正常表达。 3.验证重组质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA对基因组的敲除能力：阴性对照组的鲍曼不动杆菌ATCC17978在Amp LB平板上密集生长，在Kan LB平板上不生长；pBBR1MCS2-Cas9(+)/鲍曼不动杆菌ATCC17978在Amp LB平板上密集生长，在Kan LB平板上有散在生长；pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA(+)/鲍曼不动杆菌ATCC17978在Amp LB平板上密集生长，但在Kan LB平板上不生长。 4.验证重组质粒pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA对质粒的敲除能力：E.coli DH5α在 Chl LB平板和 Kan+Chl LB平板上不生长；pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA+pBBR1MCS/E.coli DH5α，在Kan LB平板上密集生长， Chl LB平板和 Kan+Chl LB平板上呈散在菌落生长；pBBR1MCS2-Cas9-sgRNA+pBBR1MCS-BAP/E.coli DH5α在Kan LB平板上密集生长，Chl LB平板上呈散在菌落生长，Kan+Chl LB平板上不生长。 5.构建非同源末端连接质粒：PCR鉴定及测序鉴定都表明成功构建了重组质粒pBBR1-Ku-TelR-LigD。 6.非同源末端连接质粒蛋白表达：在30kDa～40kDa之间，可观察到Ku蛋白的条带；在70kDa～90kDa之间，可观察到LigD蛋白的条带。 7.验证非同源末端连接质粒的修复能力：导入 pUC19线性片段的pBBR1-Ku-TelR-LigD(+)/E. coli DH5α可在50μg/ml Amp LB平板上生长，检测修复pUC19序列。 结论： 1.成功构建定点敲除基因的CRISPR/Cas9载体； 2.成功构建修复断裂DNA的非同源末端连接体系载体。