【摘 要】
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【研究背景与目的】鱼藤酮（Rotenone,ROT）具有神经毒性,但其机制远未阐明。研究表明长期接触ROT能诱发神经炎症。细胞焦亡是一种NLRP3介导的程序性细胞死亡方式,能产生强烈的炎症反应。碎片化的高尔基体可以激活NLRP3介导的炎症反应。同时,锌超载能够促进cGAS-STING通路激活,产生炎症反应。为此,本实验将探讨ROT是否通过诱导HT22细胞焦亡产生炎症反应,并从高尔基体碎片化和锌超载
【基金项目】
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国家自然科学基金（81771178）；
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【研究背景与目的】鱼藤酮（Rotenone,ROT）具有神经毒性,但其机制远未阐明。研究表明长期接触ROT能诱发神经炎症。细胞焦亡是一种NLRP3介导的程序性细胞死亡方式,能产生强烈的炎症反应。碎片化的高尔基体可以激活NLRP3介导的炎症反应。同时,锌超载能够促进cGAS-STING通路激活,产生炎症反应。为此,本实验将探讨ROT是否通过诱导HT22细胞焦亡产生炎症反应,并从高尔基体碎片化和锌超载激活cGAS-STING通路两个方面探讨其促细胞焦亡的机制。【方法】1.CCK8试剂盒检测HT22细胞活力;2.Golgi-Tracker Red试剂盒和GM130免疫荧光检测HT22细胞高尔基体碎片化现象;3.免疫荧光双标法观察HT22细胞中GRASP65和GM130蛋白共定位现象;4.免疫共沉淀法检测HT22细胞中GRASP65与GM130蛋白质相互作用;5.蛋白免疫印迹法检测HT22细胞GRASP65、GM130、焦亡相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD）、cGAS和STING蛋白的表达;6.ELISA试剂盒检测HT22细胞培养液上清中白介素-1β和白介素-18的含量;7.Zinpyr-1荧光探针检测HT22细胞锌离子水平。【结果】1.ROT诱导HT22细胞焦亡ROT（0.5,1,2μM,24 h）可明显降低HT22细胞活力,上调HT22细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1和GSDMD-N的表达,以及增加细胞培养液上清中白介素-1β和白介素-18的含量,表明ROT可诱导HT22细胞焦亡,具有细胞毒性。2.ROT诱导HT22细胞高尔基体碎片化ROT（0.5,1,2μM,24 h）可使HT22细胞高尔基体膜和高尔基体基质蛋白GM130分布面积增大、GRASP65和GM130的表达及两者的共定位和相互作用下降,表明ROT可诱导HT22细胞高尔基体碎片化。3.ROT导致HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路ROT（0.5,1,2μM,24 h）可明显上调HT22细胞锌离子浓度以及cGAS和STING蛋白的表达,表明ROT可以导致HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路。4.硫酸锌促使HT22细胞锌超载并激活cGAS-STING通路锌离子供体硫酸锌（100,200,400μM,8 h）可显著上调HT22细胞锌离子浓度以及cGAS和STING蛋白的表达,表明锌超载可以激活HT22细胞cGAS-STING通路。5.高浓度硫酸锌对HT22细胞具有细胞毒性硫酸锌（100,200,400μM,8 h）可显著降低HT22细胞活力,表明高浓度硫酸锌对HT22细胞具有细胞毒性。【结论】ROT可以导致HT22细胞焦亡,其机制可能涉及高尔基体碎片化和锌超载激活cGAS-STING通路。
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