研究背景与目的:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,在我国其发病率远高于欧美国家。临床上ICH主要见于中老年人,而且随着年龄的增长,脑出血患者的临床预后显著恶化,提示衰老是导致脑出血后脑损伤加重的重要原因。尽管近年来对ICH的病理生理机制研究取得了显著的进展,然而多项在ICH动物模型被证实有效的治疗药物却在临床转化研究中均显示无效。究其原因,可能与基础研究中所用的研究对象多为年轻实验动物有关,而与临床中ICH患者以中老年人群为主的客观现象不符。因此,深入阐明衰老导致ICH后脑损伤加重的作用及机制对ICH的治疗具有重要意义。研究表明年轻小鼠血浆移植到老年小鼠体内可以明显改善老年小鼠身体机能,甚至可以减轻小鼠脑出血和脑梗死后脑损伤程度,提示血浆中的某些因子可以影响大脑衰老的生理及病理过程。新近研究对血浆进行蛋白组学分析后发现,血浆中趋化因子2（Chemokine C-C motif ligand 2,CCL2）、CCL11、CCL12、CCL19、触珠蛋白（Haptoglobin）及β2微球蛋白（β2-microglobulin）等分子在老年小鼠中显著高于年轻小鼠。进一步研究发现CCL2、CCL11、CCL19、haptoglobin和β2-microglobulin等分子在正常衰老和衰老相关疾病中发挥重要作用,并且前期预实验结果发现CCL12在老年和年轻小鼠血浆中差异最显著。CCL12又名单核细胞趋化蛋白5（Monocyte chemotactic protein 5,MCP-5）,主要由单核巨噬细胞、中性粒细胞等外周免疫细胞分泌产生,在趋化诱使外周免疫细胞向受损的组织迁移并参与炎症反应中发挥重要作用。综上所述,我们提出如下假说:衰老促进ICH小鼠血浆CCL12上调,并通过招募外周炎症细胞进入脑组织,加重小鼠ICH脑损伤。材料与方法:1、构建小鼠ICH模型:构建年轻（3月龄）野生（Wild type,WT）、老年（18-20月龄）WT、老年CCL12^-/-小鼠、CCL12过表达小鼠ICH模型。然后分别在ICH后12h、1d、3d,5d、7d时取血标本及血肿周围脑组织,血标本经离心后获得血浆,所有标本收集完毕后立即冻存于-80℃冰箱中。2、构建并联共生小鼠模型:构建WT-WT,WT-CCL12^-/-,CCL12^-/--CCL12^-/-并联共生模型,该模型构建14d后再构建ICH模型。然后在ICH后1d时收集血浆及血肿周围脑组织,所有标本收集完毕后立即冻存于-80℃冰箱中。3、CCL12检测:利用ELISA检测小鼠ICH后血浆CCL12含量,用PCR、WB检测小鼠ICH后血肿周围脑组织CCL12含量。4、脑损伤指标检测:检测小鼠ICH后神经功能缺损评分、死亡率、脑含水量;利用ELISA检测小鼠ICH后血浆炎症因子的含量;利用HE、TUNEL、FJB及尼氏染色法检测小鼠ICH后血肿周围脑组织神经元的损伤与存活情况。5、外周炎症细胞浸润检测:利用免疫荧光、免疫组化检测小鼠ICH后血肿周围脑组织炎症细胞浸润情况;通过提取ICH小鼠血肿周围脑组织的炎症细胞,利用流式检测小鼠ICH后浸润出血半球的炎症细胞数量。结果:1、老年小鼠血浆和中枢CCL12表达量显著高于年轻小鼠,并且ICH后CCL12表达进一步上调。2、外周CCL12能透过血脑屏障:我们发现在WT-CCL12^-/-并联共生模型中的CCL12^-/-小鼠血浆和脑组织均检测到了CCL12的表达,而几乎检测不到CCL12 m RNA的表达,并且WT小鼠和CCL12^-/-小鼠血浆CCL12表达量接近。这一部分研究结果表明CCL12可以从外周透过BBB进入脑组织。3、CCL12加重脑出血后脑损伤:我们发现神经功能缺损评分、死亡率、脑含水量、炎症因子表达量在老年CCL12^-/-ICH小鼠较老年WT ICH小鼠显著降低。此外,我们还发现老年CCL12^-/-ICH小鼠血肿周围脑组织神经元凋亡和变性数量较老年WT ICH小鼠显著降低。相反,在老年CCL12过表达小鼠ICH后,上述指标均显著恶化。这部分研究结果表明ICH后表达上调的CCL12会加重脑损伤。4、CCL12招募巨噬细胞和T细胞加重脑出血后脑损伤:我们发现血肿周围脑组织的巨噬细胞和T细胞数量在老年CCL12^-/-ICH小鼠较老年WT ICH小鼠显著降低。相反,在老年CCL12过表达小鼠ICH后,浸润血肿周围脑组织的巨噬细胞和T细胞数量显著增加。结论我们的研究结果发现衰老导致ICH小鼠血浆CCL12进一步上调,并通过招募外周巨噬细胞和T细胞加重ICH后炎症反应,进而加重了脑损伤。该研究通过减少ICH后炎症细胞浸润来干预ICH后炎症,减轻脑损伤,为ICH的治疗提供了新的靶点。