论文部分内容阅读
目的:在本室已构建Ad.RGD空载体和Ad.RGD-ING4重组腺病毒的基础上,再构建Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53单双基因重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞(A549)的体内外抑制效应及潜在分子机制。方法:PCR克隆获得P53目的基因,在本室已成功构建pAdTrack-CMV-PolyApromoter、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter转移质粒的基础上,在多克隆酶切位点NotⅠ和XhoⅠ之间插入P53目的片段,构建pAdTrack-CMV-PolyApromoter-P53和pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter-P53重组转移质粒,再与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAdeasy-1.RGD同源重组,经QBI-293A细胞包装、扩增和效价检测后获得高滴度重组腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。本项研究共分5组:PBS组、Ad.RGD空载对照组、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组、Ad.RGD-ING4-P53双基因组。将上述各组重组腺病毒分别感染A549肺癌细胞后,荧光显微镜及流式细胞仪(FCM)检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的感染效率。各组重组腺病毒感染A549肺癌细胞后,RT-PCR和Western blot法检测目的基因ING4或/和P53基因在QBI-293A细胞和A549肺癌细胞中的表达,采用MTT法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞增殖的影响,AnexinV-PE/7-AAD双染后,FCM检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的诱导凋亡效应,PI单染,FCM检测各组A549肺癌细胞的周期变化,细胞划痕实验和Transwell法检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。Real time-PCR检测A549肺癌细胞内凋亡、周期及迁移和侵袭相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21、Cyclin E、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平,Western blot法检测A549肺癌细胞内凋亡相关基因Bax、Bad和Bcl-xl的蛋白表达水平。用A549细胞建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,通过观察并测量瘤体体积、重量研究ING4或/和P53基因表达对裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长抑制作用,免疫组化检测瘤体细胞的凋亡和周期相关基因caspase-3、bax、bcl-2、p21及血管形成相关因子vegf的蛋白表达水平。结果:pcr和酶切鉴定表明成功构建了pad.rgd-p53和pad.rgd-ing4-p53同源重组腺病毒质粒,包装扩增后各组重组腺病毒经效价检测可达109-1010pfu/ml,各组重组腺病毒对a549肺癌细胞的感染效率可达90-95%。rt-pcr和westernblot法证实了腺病毒介导的ing4或/和p53基因能够在qbi-293a细胞和a549肺癌细胞中成功表达。体外实验结果表明腺病毒介导的ing4或/和p53基因表达均能抑制a549肺癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,阻滞细胞g1期进程,抑制细胞迁移和侵袭,且ad.rgd-ing4-p53双基因组较ad.rgd-ing4和ad.rgd-p53单基因组效果更优。体内实验结果表明ing4或/和p53单双基因重组腺病毒均能抑制a549裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长,且双基因组较单基因组呈明显的抑瘤增效效果。分子机制检测表明ing4或/和p53基因表达能够上调细胞内凋亡相关基因caspase-3、bax、bad,下调bcl-2和bcl-xl的表达,上调周期相关基因p21,下调cycline的表达,下调肿瘤迁移和侵袭相关基因mmp-2和mmp-9的表达,下调肿瘤血管形成相关因子vegf的表达,且双基因组优于单基因组。结论:1、成功构建rgd-4c修饰的单双基因重组腺病毒ad.rgd-p53和ad.rgd-ing4-p53。2、rgd修饰的ing4或/和p53重组腺病毒均能显著抑制a549肺癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,阻滞细胞g1期进程,并抑制细胞迁移和侵袭,且ad.rgd-ing4-p53双基因共表达组较ad.rgd-ing4和ad.rgd-p53单基因组效果更为明显。3、ad.rgd-ing4-p53双基因共表达较ad.rgd-ing4或ad.rgd-p53单基因表达在体内对a549人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长产生更加显著的抑瘤效应。4、腺病毒介导的ing4或/和p53基因表达能通过上调细胞内周期相关基因p21和下调cycline的表达阻滞细胞g1期进程,上调凋亡相关基因caspase-3、bax、bad和下调bcl-2、bcl-xl的表达诱导细胞凋亡,下调肿瘤迁移和侵袭相关基因mmp-2,mmp-9的表达抑制细胞的迁移和侵袭,下调裸鼠移植瘤内肿瘤血管形成因子VEGF的表达抑制肿瘤新血管的生成,且Ad.RGD-ING4-P53双基因共表达较Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53单基因表达对上述因子的调控作用更为明显,这可能是双基因共表达发挥抑瘤增效作用的重要机制之一。