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挥发性脂肪酸(Volatile fatty acids,VFA)在反刍动物瘤胃中发酵后成为宿主主要的能量供应形式,课题组前期体外瘤胃上皮细胞中的研究表明,PER2与VFA的吸收存在一定相关性,但是,具体的调控作用和机制尚不明确。因此,本研究通过体外沉默及体内敲除生物钟基因PER2,探究PER2对消化道上皮VFA吸收的调控机制。试验一、体外培养瘤胃上皮组织研究PER基因表达与VFA吸收相关基因的关系本部分试验选择3月龄波尔山羊作为试验动物进行体外培养瘤胃组织,试验分为四组:对照组、乙酸组、丙酸组和丁酸组。培养内液为缓冲液与瘤胃液1:1的混合液,再分别添加15 mmol/L乙酸、丙酸、丁酸;培养外液为常规培养液。分别采集Oh、3 h、6h、24h的培养内外液,测定其pH和OD值、氨氮浓度、VFA浓度;采集Oh和24h的瘤胃组织样测定PER2等生物钟基因和VFA相关基因表达量。结果发现:氨氮浓度随培养时间增加有所提高(P<0.05),但各处理组间无显著差异(P>0.05);乙酸、丙酸和丁酸摩尔浓度分别在乙酸组、丙酸组和丁酸组极显著高于其他三组(P<0.05);丙酸组中PER2的相对表达量显著高于其他各组(P<0.05),乙酸组、丁酸组和对照组间差异不显著(P>0.05);不同VFA处理显著抑制CLOCK基因的表达(P<0.05),PPAR-a、PRAR-γ基因的相对表达量组间差异均不显著(P0.05);在VFA相关吸收基因和PER2基因表达的相关性中,生物节律基因PER2与AE2基因的相对表达呈正相关,与MCT1基因的相对表达呈负相关(P<0.05)。体外培养瘤胃上皮组织研究证实了,PER2基因通过正向调控AE2基因、负向调控MCT1基因,与VFA相关基因存在一定的相关性。试验二、PER基因沉默对瘤胃上皮细胞增殖及VFA吸收蛋白表达的影响本部分试验采用三组siRNA干扰序列(iRNA-PER2-a/b/c)对波尔山羊瘤胃上皮细胞进行转染,分别在36 h、48 h和60 h用Real-time PCR技术对不同序列的干扰片段测定PER2基因mRNA表达量,以评价siRNA的转染效率。在此基础上,筛选沉默效果最佳的干扰片段和转染时间点再进行后续试验,分为对照组和试验组(沉默组)。试验采用CCK8法(Cellcounting8)测细胞活力,Annexin V-FTC试剂盒测细胞凋亡;采用Real-time PCR和Western-bolt方法测定生物钟及VFA吸收相关基因mRNA转录水平和蛋白表达水平。结果显示:干扰片段siRNA-PEER2-b在48h沉默效果较好,试验组PER2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.05),PER2基因的沉默效率达到72.07%。表明所选siRNA片段沉默PER2基因效果良好。采用该干扰片段沉默PER248h后发现,试验组细胞活力随时间先显著下降再显著上升(P<0.05),但试验组在凋亡早期与凋亡晚期均显著低于对照组(P<0.05)。此外,试验组显著下调了 CLOCK、PPAR-和PPAR-γ基因的mRNA水平(P<0.05),显著上调了PPAR-β、PMCT1和MCT4基因的mRNA水平(P<0.05),但对AE2和VHE1基因mRNA转录水平没有显著影响(P>0.05)。试验组PPAR-a蛋白含量显著低于对照组,但试验组中NHE1蛋白含量显著高于对照组(P<0.05)。瘤胃上皮细胞PER2基因沉默试验,证实了PER2通过正向调控CLOCK、PPAR-a和PAR-γ基因、负向调控PPAR-β、MCT1和MCT4基因调控瘤胃上皮细胞VFA的吸收。试验三、PER敲除对小鼠后消化道VFA吸收蛋白和TLR蛋白表达的影响本部分试验选用北京百奥赛图基因生物技术有限公司提供PER2基因敲除型纯合子小鼠8只(雌雄各4只)为试验组,以野生型小鼠8只(雌雄各4只)为对照组,每组各4对小鼠,雌雄各半。在8h光照和16 h黑暗的交替光周期中饲喂2周后脊椎脱臼法处死,采集小鼠结肠和盲肠内容物测定VFA浓度,采集上皮组织样测定Toll因子含量、VFA吸收相关基因及蛋白含量。结果显示,试验组小鼠盲肠丙酸摩尔浓度显著下降而丁酸摩尔浓度则显著上升(P<0.05)。试验组小鼠结肠上皮组织中TLR2蛋白表达水平显著下调,盲肠上皮组织中MyD88蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。另外,结肠上皮组织的MCT1及盲肠上皮组织的PPAR-β和NHE1基因转录水平上调(P<0.05)。另外,在结肠和盲肠上皮组织中,敲除PER2基因均显著下调PER2蛋白含量以及显著上调NHE1和PPAR-α蛋白含量(P<0.05)。敲除小鼠PER2基因试验研究发现,PER2基因可能通过上调结肠上皮组织MCT1基因和盲肠上皮组织PPAR-β和VHE1基因机制调控小鼠肠道VFA的吸收。综上:PER2低表达或敲除通过上调了 MCT蛋白促进了单羧酸从肠上皮细胞向组织的代谢。具体通路关系有待进一步地深入研究。