布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一类动物源性疾病,是重要的人畜共患病,在世界各地都有广泛流行,尤其是在发展中国家。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,在细胞内的生存和复制是布鲁氏菌的主要毒力特征。Ⅳ型分泌系统(TypeⅣsecretion systems,T4SS)是一种能分泌细菌毒力因子的多蛋白复合物,是病原菌的一个重要毒力武器。布鲁氏菌中也有T4SS,已有研究表明,T4SS与布鲁氏菌的胞内生存密切相关,但该系统如何影响或调控布鲁氏菌的胞内生存和复制至今尚未阐明。本研究利用同源重组的方法,构建T4SS失活的突变株,然后比较突变株与野生株胞内生存相关表型的差异,确定T4SS影响的表型。利用比较蛋白质组的方法,比较分析突变株与野生株蛋白表达的差异,根据差异蛋白的功能信息及其在突变株中的变化,从蛋白的角度来解释突变株胞内生存相关表型的变化。利用定量RT-PCR探讨T4SS对这些差异表达蛋白在胞内生存相关环节的影响及调控,解释T4SS调控布鲁氏菌胞内生存的分子机制。为分析T4SS影响的表型及其调控的靶基因,首先需要构建T4SS的突变株和互补菌株。由virB操纵子(virB)编码的T4SS是一个含有11个可跨越细菌被膜的多蛋白复合物,由同一启动子调控。因此,要想失活整个T4SS,只用缺失启动子区域即可。我们首先利用自杀质粒pUC19-SacB构建了virB启动子区域缺失的突变株。然后,利用质粒拯救原理克隆了长达11 kb的virB操纵子,并将其亚克隆到能在布鲁氏菌中复制的pBBR1MCS-5载体中,构建了互补质粒。将互补质粒转入到virB突变株中获得了互补株。用半定量RT-PCR的方法对构建的突变株和互补株中virB的转录进行验证,结果表明突变株中的virB操纵子没有转录活性,而互补株中virB操纵子的转录活性得到恢复,表明突变株和互补株构建成功。在构建了virB的突变株和互补株之后,我们对野生株、突变株和互补株的胞内生存相关表型进行了比较,分析virB的缺失和过表达影响布鲁氏菌的哪些表型,尤其是与胞内生存相关的表型。细胞黏附和侵袭实验结果显示,virB突变株对巨噬细胞的粘附能力增加,但入侵巨噬细胞的能力没有变化,提示virB突变株的表面结构可能发生了改变,影响了布鲁氏菌与巨噬细胞的黏附,但不影响最终的侵入。胞内存活及小鼠体内生存实验显示,virB突变株虽然可以入侵巨噬细胞并在小鼠的脾脏和肝脏细胞内生存,但在巨噬细胞内的生存能力减弱,在小鼠体内很快被清除,表明T4SS对于布鲁氏菌在宿主细胞内的复制、长期生存、建立慢性感染是必需的。从宿主的角度看,virB突变株的毒力明显减弱,对宿主的病理损伤减轻。此外,virB突变株对高盐和渗透压的抵抗力降低,对多粘菌素B的敏感性增加,表明T4SS在维持外膜结构的稳定性,抵抗环境压力中发挥了重要作用。突变株对过氧化氢、酸等刺激因素的抵抗力降低,提示T4SS在布鲁氏菌适应胞内的恶劣环境中发挥一定的作用。布鲁氏菌的T4SS对外膜结构的影响还表现在生物膜的形成方面,virB突变株在培养至静止期后可合成胞外多糖、形成生物膜样的聚集,表明布鲁氏菌可在一定的条件下形成生物膜,而且T4SS在这个过程中发挥了一定的调控作用。我们在实验中发现,与野生株相比,互补株(virB过表达)在巨噬细胞和小鼠体内的生存能力减弱,提示virB的过度表达对于布鲁氏菌的胞内生存是不利的。细胞毒力检测结果显示,virB过表达的菌株对巨噬细胞具有明显的细胞毒性,而virB突变株的细胞毒性明显减弱,提示布鲁氏菌的胞内生存需要T4SS的正确诱导表达,virB的缺失和过表达对于布鲁氏菌的胞内生存均是不利的。在比较分析了T4SS影响的布鲁氏菌胞内生存相关表型后,我们对virB突变株和野生株进行了比较蛋白组研究,分析virB失活以后布鲁氏菌蛋白质组的改变,试图通过分析蛋白质表达的差异来解释T4SS可能的作用机制。首先,利用定量RT-PCR分析了virB在模拟巨噬细胞内环境的体外不同刺激条件下的转录,确定了virB体外高效诱导表达的条件。结果显示,在酸化的基础培养基(GEM4.0)中培养3 h时布鲁氏菌的virB转录水平最高。然后,利用双向电泳-质谱的蛋白质组研究方法比较了突变株与野生株在virB高表达条件下蛋白表达的差异。结果表明:1、virB突变株外膜蛋白的表达发生明显改变,细胞膜的主要组成部分——脂类的合成减少,提示膜的完整性发生了改变,表明作为外膜结构组分的T4SS在维持布鲁氏菌外膜结构的完整性中起重要作用。2、差异表达的外膜蛋白Omp25和Omp31在双向电泳胶图上普遍存在一个蛋白对应于凝胶上的多个点,提示这些蛋白存在翻译后修饰,分别执行不同的功能,T4SS可能影响或调控了这些外膜蛋白的翻译后修饰。3、virB失活以后,与胞内生存相关的毒力蛋白Omp25、DnaK、HtrA、VjbR、GntR的表达量减少,提示T4SS可能通过调控毒力相关蛋白的表达来调控布鲁氏菌的胞内生存。4、virB突变株中热休克蛋白和蛋白水解酶的表达量减少,这些蛋白表达的减少可导致错误折叠蛋白、毒性蛋白和杀菌物质的积累,因此,T4SS有利于布鲁氏菌对错误折叠蛋白的降解,促进蛋白的正确折叠,从而有利于布鲁氏菌的胞内生存。5、virB突变株的铁代谢相关蛋白的表达发生了改变,可能引起胞内的铁含量减少,这表明T4SS有利于布鲁氏菌在胞内对铁的摄取。6、virB失活以后,布鲁氏菌的能量代谢相关蛋白、生糖氨基酸表达量减少,能量主要来源的脂类合成减少,蛋白的合成也减少,提示突变株的代谢受到抑制,T4SS有利于布鲁氏菌对营养缺乏环境的适应。总之,比较蛋白质组的分析结果显示,virB影响了大量蛋白的表达,而这些蛋白大多与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关。这些蛋白表达的变化可能影响了布鲁氏菌的胞内生存相关表型,从而导致布鲁氏菌的胞内生存能力减弱,毒力降低。比较蛋白质组研究结果表明,virB突变株中一些重要的毒力蛋白,特别是胞内生存相关蛋白的表达下调,表明virB调控了这些蛋白的表达。为进一步验证和分析virB对这些蛋白的调控作用,我们利用定量RT-PCR分析了野生株、突变株和互补株中毒力基因virB、virR、dnaK、htrA、omp25、gntR在体外刺激条件和巨噬细胞感染过程中的转录变化。结果显示,virB及其调控的基因vjbR、dnaK、htrA、omp25和gntR在体外刺激条件和侵染细胞中的转录上调,说明这些基因在这些条件下被激活并发挥了一定的作用,从而有利于布鲁氏菌在这些条件下的生存。与野生株相比,突变株中毒力基因vjbR、dnaK、htrA、omp25和gntR的转录下调,在互补株中得到了恢复,表明virB在胞内生存相关环节调控了这些毒力基因的转录。T4SS可能通过调控毒力基因的表达,使布鲁氏菌能够抵抗和适应细胞内的各种恶劣环境,从而能够在胞内存活。virB突变株中这些毒力基因的转录水平下调,与突变株在这些条件下的生存率下降是相关的,进一步说明了vf旭对这些毒力基因的调控作用。体外刺激条件以及细胞侵染过程的转录显示,酸是virB诱导表达的一个重要因素,布氏小体的早期酸化是virB胞内诱导表达的主要因素,也是virB调控的这些毒力基因的激活信号。因此,布鲁氏菌可能通过在感染早期协调这些毒力基因的表达,适应宿主细胞的环境并避免降解。vjbR是密度感应系统的转录激活蛋白,是一个与细菌密度有关的调控因子,实验结果表明,virB和vjbR存在互为正调控的关系,而且virB对vjbR的调控具有生长时期依赖性。以上研究结果显示,virB突变株的多个胞内生存相关表型发生了变化,在胞内和小鼠体内的生存能力降低,进一步证实T4SS通过影响布鲁氏菌的表型来实现其在胞内的生存。比较蛋白质组和定量RT-PCR的研究表明,T4SS通过维持布鲁氏菌外膜结构的稳定性,调控胞内生存相关蛋白的表达,使布鲁氏菌能够抵抗和适应胞内外的恶劣环境,从而能够在巨噬细胞内生存复制,并在小鼠体内建立慢性感染。通过本课题的研究,对T4SS在布鲁氏菌胞内生存中的作用有了进一步的认识,对其调控布鲁氏菌胞内生存的分子机制有一个初步的了解,为深入研究布鲁氏菌胞内生存相关的分子机制提供了重要线索。