论文部分内容阅读
目的：丙烯腈是不可或缺的有机化工原料之一,主要用来生产腈纶纤维、染料、塑料、聚丙烯酰胺和树脂等化工产品。近年来,随着相关产品需求量的迅猛增加,AN产业规模不断扩大,职业、生活接触机会也相应增多。所致的事故性急性AN中毒事件也有所上升。因此为接触人群寻找有效的保护剂,特别是神经保护剂已成为国内外学者的重要任务。现有的研究表明内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)可以减轻或拮抗神经、肝、肾等脏器损害,因此本研究首次综合整体动物在体和离体染毒实验,研究内质网应激诱导剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)和氧化二硫苏糖醇(trans-4,5-dihydroxy-1,2-dithiane,DTTPox)预处理对AN毒性的保护作用及可能机制,特别是细胞自噬激活在内质网应激诱导的细胞保护中的作用。
方法：
(1)ERS诱导剂对AN损伤AST的保护作用及其机制:原代培养新生大鼠星形胶质细胞(astrocytes,AST),实验分两步:一,研究2-DG和DTTox单纯处理大鼠AST,观察2-DG和Dtrox不同浓度及不同处理时间对AST的影响,特别是对内质网应激及细胞自噬的影响;二,进行2-DG和Dtrox预处理,研究2-DG和Dtrox诱导内质网应激及细胞自噬等在AN染毒AST中的保护作用。随机分为空白对照组、单纯AN染毒组(2.5mM处理12h)、不同浓度的2-DG(1mM、5mM、10mM)分别预处理12、24h、不同浓度的DTTox(1mM、5mM、10mM)分别预处理1、3h。通过MTT比色法检测细胞活性;LDH(lactatedehydrogenase)漏出率检测细胞毒性;通过荧光素DCF-DA探针采用荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)含量;采用JC-1探针分析线粒体膜电位(△Ψm);蛋白印迹法确认内质网应激的标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、p-PERK和自噬的标志蛋白LC-3、Beclin1蛋白表达变化。
(2)自噬抑制剂3-MA(3-Methylamphetamine)预处理对2-DG和DTTox保护作用的影响:进行大鼠AST原代培养,随机分为空白对照组、单纯AN染毒组(2.5mM处理12h)、单纯3-MA处理组(10mM处理12h),单纯2-DG处理组(5mM处理12h),单纯DTTox处理组(5mM处理3h),3-MA预处理的2-DG诱导组(5mM浓度)和DTTox诱导组(5mM浓度)。通过MTT比色法检测细胞活性。
(3)ERS诱导剂对AN染毒大鼠急性毒性的保护作用及其机制:在体染毒实验分两步:一,诱导剂最优剂量的选择28只大鼠随机分为4组,分别给予50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg浓度的2-DG,同时设立生理盐水对照组,研究2-DG的剂量-效应关系,同时为下步实验选择合适剂量;二,诱导剂预处理对AN氧化应激的影响36只SD大鼠随机分为6组,三个浓度的2-DG(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)处理组每12h腹腔注射一次,持续一周,最后一次注射后8h分别再给予50mg/kg、75mg/kgAN,染毒1h后麻醉断头处死,同时设立生理盐水对照组及单纯AN(50mg/kg、75mg/kg)组。蛋白印迹法(WesternBlot)检测脑、肝脏组织内质网应激的标志性蛋白GRP78、PERK、p-PERK和自噬的标志蛋白LC-3的表达以及氧化应激指标脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。
结果：
(1)ERS诱导剂对AN染毒AST的保护作用
1)与空白对照组相比,单纯AN染毒组导致AST活性明显下降(P＜0.05);而单纯2-DG组和单纯DTTox组预处理后,及2-DG+AN组和DTTox+AN组分别预处理不同时间后,MTT法检测其细胞活性显著升高(P＜0.05)。
2)与空白对照组相比,单纯AN染毒组的LDH漏出率显著增加(P＜0.05);而单纯2-DG组和单纯D邢Dx组预处理后,及2-DG+AN组和Dtrox+AN组分别预处理不同时间后,LDH漏出率显著降低(P＜0.05)。
3)与空白对照组相比,单纯AN染毒组活性氧(ROS)生成显著增多(P＜0.05),线粒体膜电位(△Ψm)显著下降(P＜0.05),而2-DG(5mM,12h)+AN和DTTox(5mM,3h)+AN预处理组显著抑制AN诱导的ROS升高(P＜0.05),显著提高了线粒体膜电位(△Ψm)。
4)WesternBlot结果显示2-DG和DTTox上调GRP78、PERK、Beclin1蛋白的表达。P-PERK显著增加。诱导LC-3活化,使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换。
(2)自噬抑制剂3-MA预处理对2-DG和DTTox保护作用的影响
与空白对照组相比,单纯AN染毒组导致AST活性明显下降(P＜0.05),而与ERS诱导剂预处理+AN组比,自噬抑制剂3-MA预处理组显著抑制内质网应激诱导剂2-DG和Dtrox诱导的保护作用(P＜0.05)。
(3)ERS诱导剂对AN急性氧化毒性的保护作用及其机制
1)2-DG最佳诱导剂量的选择:2-DG(50、100、200mg/kg)单纯处理后蛋白印迹法结果显示,与生理盐水组比,2-DG(50、100、200mg/kg)处理组的脑、肝组织的GRP78蛋白表达水平升高,以100mg/kg浓度组升高最显著。LC-3蛋白表达结果显示2-DG诱导了LC-3蛋白活化,使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换。
2)2-DG单纯处理组脑、肝组织的GRP78、PERK的蛋白表达显著增加,表明内质网应激的激活。
3)与单纯AN处理组(50、75mg/kg)比,2-DG预处理组(100mg/kg)脑、肝组织的Beclin1蛋白表达显著增加,以及诱导了LC-3活化,使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换,表明内质网应激使细胞自噬被激活。
4)与对照组比,AN组MDA在脑组织和肝组织中显著增加(P＜0.05),AN组GSH含量在脑组织和肝组织显著减少(P＜0.05),脑、肝组织SOD活性显著下降(P＜0.05),与AN单纯组相比,2-DG+50AN预处理组和2-DG+75AN预处理组脑组织和肝组织MDA水平均降低,但以2-DG+50AN预处理组MDA水平降低最显著(P＜0.05)。与AN单纯组相比,2-DG+50AN预处理组和2-DG+75AN预处理组脑组织和肝组织的GSH含量、SOD活性均显著增加(P＜0.05)。
结论：
内质网应激诱导剂能够显著提高AN染毒星形胶质细胞的细胞活力,减少细胞毒性,抑制AN诱导的ROS生成。内质网应激诱导剂能够增强内质网应激标志蛋白GRP78、PERK表达,使p-PERK蛋白磷酸化增加,表明适当的内质网应激可以保护细胞抵抗AN的毒性。内质网应激诱导剂也使自噬应激的标志蛋白LC-3活化和Beclin1蛋白的表达增强,说明白噬激活可能是内质网应激诱导的保护机制。通过生化指标MDA、GSH、SOD的测定,2-DG预处理能显著降低脑组织和肝组织MDA水平,显著增加GSH含量、SOD活性,可以说明氧化应激被激活并对脑肝组织有保护效应。