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天然免疫是后生动物在种系发生和演化过程中形成的防御功能,在机体抵抗外源生物入侵的过程中发挥着重要作用。在后生动物中,外源生物入侵机体后,会被天然免疫系统所识别,进而激活免疫信号通路产生效应分子。病毒是后生动物的一种重要的外源生物,以往关于宿主的抗病毒天然免疫研究主要集中于脊椎动物,然而,对于无脊椎动物的抗病毒天然免疫研究较少。这制约着对天然免疫系统及其功能的发生发展过程的理解。本研究中,利用棉铃虫(Helicoverpa armigera)和棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)互作来研究病毒对宿主免疫的动态调控;同时,对棉铃虫中肠微生物在病毒与宿主互作中的作用进行了研究。 黑化反应是普遍存在于无脊椎动物中的一种防御机制。酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)是黑化反应的关键酶,PPO的激活由Clip结构域丝氨酸蛋白酶(Clip-domain serine protease,cSP)级联反应介导,并被丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitors,serpins)所严格调控。在本研究中,通过定量蛋白质组学和免疫印迹实验发现,HearNPV感染3龄末期棉铃虫后,宿主血淋巴内黑化反应系统中大部分组分的蛋白表达被下调,包括cSP4,cSP6,cSP8和cSP29;少数免疫蛋白被上调,其中serpin-9和serpin-5的蛋白表达分别在感染后48和72小时被上调。进一步研究还发现,HeaNPV感染显著抑制宿主血淋巴酚氧化酶(PO)活力。而体外实验证实,激活血淋巴黑化反应能够杀灭杆状病毒。这就说明杆状病毒通过抑制宿主黑化反应进而增殖。 进一步通过进化分析、免疫共沉淀和酵母双杂交实验发现,serpin-5可能是cSP4的抑制剂,而serpin-9则可能是cSP6、cSP29的抑制剂。cSP6属于CLIPB亚家族,很可能是PPO的直接激活酶,cSP4是CLIPC,可能是PPO另一个激活酶cSP8的上游激活酶。理论分析和实验验证初步揭示了棉铃虫体内存在着一个完善的黑化反应激活系统,这一防御手段的存在对杆状病毒在棉铃虫中的感染是一个阻碍,因此杆状病毒需要对其进行抑制以达到成功感染的目的。 为了从生化角度验证宿主黑化反应应对病毒感染的机制,需要在体外重建黑化反应激活系统。因此,利用细菌表达系统表达和纯化了serpin-5和serpin-9,利用果蝇细胞表达系统表达和纯化了cSP4和cSP6,并从5龄棉铃虫中纯化出了PPO蛋白。研究显示serpin-5和serpin-9蛋白能够抑制血淋巴的黑化反应。进一步生化实验证明,serpin-5能有效抑制cSP4的蛋白酶酶活;serpin-9通过抑制cSP6的蛋白酶酶活来负调控黑化反应;cSP6则能够直接剪切从血淋巴中纯化的PPO,而被剪切活化的PPO能释放PO活力。最后,利用dsRNA在虫体内干扰serpin-5或serpin-9,发现病毒载量下降和死亡率下降。上述研究表明,棉铃虫病毒感染诱导血淋巴中serpin-9和serpin-5蛋白表达时序上调,serpin-5抑制cSP4酶活,serpin-9抑制cSP6酶活,从而导致血淋巴的PO活力下调,抑制了宿主的黑化反应,促进了病毒的感染。 肠道微生物是存在于大多数后生动物肠道中的微生物菌群,它们在宿主行为、代谢和免疫等生理活动中发挥着重要作用。在本研究中,通过饲喂抗生素将棉铃虫的中肠微生物清除后,发现HearNPV感染的棉铃虫死亡率下降。进一步用16SrRNA基因测序分析发现,病毒感染后会导致宿主中肠微生物菌落多样性下降。最后,通过RNA干扰对病毒诱导的免疫分子CTL19进行抑制后,发现棉铃虫中肠的微生物丰度降低,推测CTL19参与调控棉铃虫中肠微生物稳态。 综上所述,本研究展示了杆状病毒抑制宿主天然免疫的分子机制。杆状病毒的感染诱导了丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达,从而抑制了血淋巴中黑化反应的激活,促进了杆状病毒的感染。另外,还揭示了宿主肠道微生物促进杆状病毒的感染并受到杆状病毒的调控。本研究揭示了杆状病毒抑制宿主天然免疫的分子机制,同时还为理解和认知天然免疫系统的演化作了铺垫。