人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor, hG-CSF)是一种定向作用于粒系祖细胞的造血生长因子。它作用于粒系祖细胞,可以特异刺激祖细胞向中性粒细胞增殖分化,并维持其功能和存活[1]。临床上主要用于骨髓移植时促进中性白细胞增加、癌症化疗引起的严重中性粒细胞缺乏症。但是G-CSF的半衰期短,临床治疗应用时需反复使用才能维持有效的血药浓度,这导致病人的治疗费用高,病人的依从性差。本课题的目的是利用融合蛋白的方法,构建具有更长半衰期的新型G-CSF,以取代普通的G-CSF。根据文献报道,有一种从噬菌体肽库中筛选出来十肽能够特异结合人IgG的Fc段(IgG Fc)。将编码此小肽的基因与人G-CSF基因融合融合,构建rhG-CSF融合蛋白(rhG-CSF-tag1)基因。首先,设计引物,以rhG-CSF表达载体pBV-G-CSF为模板,进行PCR反应,扩增rhG-CSF编码区,及C-末端融合有多肽基因rhG-CSF融合蛋白(rhG-CSF-tag1)基因。将PCR产物以及空载体pBV220分别用EcoRI和BamHI双酶切,然后,将酶切产物连接构建出原核表达载体pBV-G-CSF和rhG-CSF-tag1。经双酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定,表明两个重组质粒中的目的基因序列正确。将阳性重组质粒转化大肠杆菌表达菌DH5α,在30℃条件下培养rhG-CSF和rhG-CSF-tag1工程菌, 42℃温度诱导目的蛋白的表达,并对目的蛋白在菌体内的表达形式进行分析。SDS-PAGE结果显示,与对照菌相比,温度诱导后的重组菌在分子量为19～21kDa处有目的蛋白表达。进一步实验分析表明,在当OD600达到0.4～0.6时,升温至42℃温度诱导表达4h,目的蛋白质的表达量最大,并且表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在。将rhG-CSF和rhG-CSF-tag1包涵体用各种不同的缓冲液进行洗涤,可以去除一些杂蛋白,然后用尿素和盐酸胍裂解包涵体,4℃透析复性,复性后的目标蛋白用DEAE阴离子交换柱进行纯化,收集目的蛋白质洗脱峰,得到纯化的目的蛋白。将目的蛋白用Tris-HCl (pH8.0)缓冲液透析,之后换为HAc-NaAc(pH4.0)缓冲液继续透析。用G-CSF依赖株细胞株NFS-60细胞进行rhG-CSF和rhG-CSF-tag1的体外活性测定。MTT法检测表明,rhG-CSF和rhG-CSFtag1均能维持NFS-60细胞的存活与增殖。用牛血清白蛋白作为标准蛋白绘制标准蛋白曲线,测出rhG-CSF和rhG-CSFtag1的蛋白浓度。最后,采用6～8周龄Balb/C小鼠,建立化疗后白细胞低下小鼠模型,构建成功后,分为阴性对照组、rhG-CSF治疗组和rhG-CSFtag1组,分别注射10mM醋酸盐缓冲液、rhG-CSF和rhG-CSFtag1。然后,每天对各组小鼠的白细胞进行计数。结果成功构建了rhG-CSF和rhG-CSF-tag1表达载体,实现了其在大肠杆菌中高效表达。体外活性测定表明,复性后的rhG-CSF和rhG-CSF-tag1均能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60细胞的存活与增殖。动物实验表明,融合蛋白rhG-CSF-tag1具有比rhG-CSF更长的体内活性,这表明,rhG-CSF-tag1在体内具有比rhG-CSF更长的半衰期。