【研究背景】组织因子是一种含有糖基的单链跨膜蛋白,分子量47KD。人组织因子基因定位于染色体1p21-1p22,整个基因包括结构基因和调节序列两部分,结构基因由6个外显子和5个内含子组成,长约12.4kb。其基因编码的前体蛋白为295个氨基酸,经过加工剪掉32个氨基酸后成为含263个氨基酸的组织因子蛋白。成熟的组织因子蛋白包括胞外219个氨基酸,跨膜区23个氨基酸,胞内区21个氨基酸。组织因子是启动凝血的关键因子,它可以同时激活凝血因子Ⅸ和Ⅹ,从而启动内、外源性两种凝血酶联放大反应,在凝血过程中起着重要作用。随着对组织因子研究的加深,现在已知组织因子可以不仅作为凝血因子启动凝血途径,而且在动脉粥样硬化、胚胎血管发育、肿瘤生长和转移、炎症、信号转导中都具有重要的作用。鉴于组织因子在多种生理和病理过程中起着重要的作用,对其表达进行调控就可以干预组织因子相关疾病的病理进程,因此针对调控组织因子表达的研究具有重大的理论意义和临床实用价值。研究表明,组织因子的表达主要在转录水平上受调控,它的启动子区包含有:5个SP1、3个Egr-1、2个AP-1、1个NF-κB位点。其中SP1位点主要负责调控组织因子的本底水平的组成性表达,而Egr-1、AP-1和NF-κB位点则主要负责内皮细胞和单核细胞中诱导性组织因子的表达。应用人单核细胞系THP-1细胞研究组织因子表达的研究证实,存在一个56bp的增强子(-227-172)介导人组织因子的产生。这个启动子含有一个NF-κB位点和两个AP-1位点,这三个位点对诱导性组织因子的产生是必需的。NF-κB信号通路在进化的早期就已建立,在果蝇和贝类中就可发现。NF-κB是Rel家族蛋白形成的二聚体。Rel家族成员N端都含有由大约300个氨基酸组成的保守序列,称为rel同源结构域(RHD)。这个结构域的同源性高达50%以上,它与Rel家族蛋白二聚体化、入核、DNA结合等功能密切相关。哺乳动物Rel蛋白家族的成员主要有五种,即p65、RelB、c-Rel、p100/p52和p105/p50。p50和p52分别从其前体(p105和p100)加工而来,从p105加工成p50的过程是组成性的,而将p100剪切成p52的过程是一个包括磷酸化和泛素化的受调控的过程。p65、c-Rel、RelB具有C端活化区域,可以激活目标基因的转录,其中活化作用最强的是p65。p50和p52自身是不能活化转录的,但与p65、c-Rel和RelB组成二聚体后可活化目标基因的表达。在以往的研究中,p65/c-Rel被认为是作用于组织因子启动子中的NF-κB位点的主要Rel家族蛋白二聚体,但是对于p50/p65是否可以调控组织因子则没有深入而系统的研究。在Rel家族蛋白形成的二聚体,含量最丰的二聚体是p50/p65,p50/p65是NF-κB信号通路的主要执行因子,所以探讨其是否可以调控组织因子的表达具有理论意义和临床应用价值。虽然p50自身不能活化转录,但是p65的进核需要依赖p50,只有p50和特定的DNA靶序列结合以后,p65才能发挥其活化作用。既然p65发挥调控基因作用的前提是p50能否结合到靶DNA序列,因此探讨p50是否可以与组织因子启动子中的NF-κB位点结合就可以明确p50/p65是否可以调控组织因子的表达。【目的】本研究旨在探寻:(1)核因子-κB p50亚基是否调控组织因子的表达;(2)核因子-κB p50亚基调控组织因子在实验性动脉内膜增生中的作用;(3)初步筛选靶向抑制核因子-κB p50亚基的小分子化合物。【研究方法】本研究分为体外实验和体内实验两部分。一.体外实验:探寻核因子-κB p50亚基调控组织因子表达的分子机制。(一)分离并培养人脐静脉血管内皮细胞、小鼠肺静脉内皮细胞、人外周单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞备用。(二)用核因子-κB p50亚基抑制剂——穿心莲内酯预处理人及小鼠的内皮细胞和巨噬细胞,再用脂多糖、佛波酯、肿瘤坏死因子分别刺激上述细胞,然后应用组织因子活性测定技术、蛋白免疫印记技术检测通过穿心莲内酯药物干预或/和p50基因敲除是否可以起到下调活化的内皮细胞和白细胞组织因子表达的作用。(三)应用细胞转染和荧光素酶报告基因实验以证明穿心莲内酯阻止核因子-κB p50亚基与TF-κB位点(组织因子启动子中NF-κB结合的位点)的结合,而不是AP-1,Sp1和Egr-1位点。(四)分别应用电泳迁移率变动分析、染色体免疫沉淀两种技术手段证明p50是否可以与人组织因子启动子中的TF-κB位点结合。(五)将人脐静脉血管内皮细胞、小鼠肺静脉内皮细胞、人外周单核细胞、小鼠腹腔巨噬细胞按照5000个/孔的密度接种到96孔细胞培养板上,应用细胞增值实验(MTT)明确穿心莲内酯有无细胞毒性。二.体内实验:证明核因子-κB p50亚基对组织因子表达调控的功能重要性。(一)将实验动物进行如下分组:(1)C57鼠只进行左侧颈总动脉结扎而不给予任何药物,作为正常模型组;(2)C57鼠在左侧颈总动脉结扎后给予穿心莲内酯治疗,作为药物实验组;(3)C57鼠在动脉结扎后给予DMSO(溶解穿心莲内酯的溶剂)治疗,作为溶剂阴性对照组;(4)C57鼠在动脉结扎后给予氢化穿心莲内酯(穿心莲内酯的非活性形式)治疗,作为药物阴性对照组;(5)C57鼠进行左侧颈总动脉结扎后给予穿心莲内酯加组织因子抗体复合治疗;(6)C57鼠在动脉结扎后给予组织因子抗体治疗;(7)C57鼠在动脉结扎后给予IgG治疗,作为组织因子抗体治疗组的阴性对照组;(8)p50敲除鼠只进行左侧颈总动脉结扎而不给予任何药物;(9)p50敲除鼠进行左侧颈总动脉结扎后给予穿心莲内酯治疗;(10)p50敲除鼠进行左侧颈总动脉结扎后给予组织因子抗体治疗;(1l)B6野生对照鼠,该组动物只进行动脉结扎而不给予任何药物,作为野生鼠正常模型组。(二)通过结扎实验动物左侧颈总动脉完成实验性动脉内膜增生的动物模型。(三)利用H&E染色、EVG染色技术显示血管的弹性膜,统计各实验组之间增生内膜、内膜/中膜比值之间的差异,评价单独或复合应用穿心莲内酯治疗、组织因子多克隆抗体治疗、p50基因敲除在实验性动脉内膜增生中的作用。(四)利用免疫组化、免疫灰度统计、免疫荧光共定位等技术,观察穿心莲内酯治疗和p50敲除对组织因子、E-selectin、VCAM-1表达的影响。(五)获取人动脉脉管炎标本,应用免疫组化技术了解NF-κB目标蛋白如组织因子、E-selectin、VCAM-1等和临床疾病的相关性。【结果】本研究的实验数据表明:(1)从p50敲除鼠分离的内皮细胞和巨噬细胞活化后,组织因子的表达减少;(2)穿心莲内酯能够抑制活化内皮细胞和巨噬细胞组织因子的表达;(3)p50蛋白能与人组织因子启动子中的TF-κB位点结合,穿心莲内酯特异性地抑制p50结合到TF-κB;(4)抑制p50蛋白或敲除p50基因可以减轻动脉内膜增生;(5)取材于本研究体内实验的的组织标本证明,浸润的巨噬细胞、活化的内皮细胞及平滑肌细胞表达组织因子;(6)抑制p50蛋白或者敲除p50基因可以减少动脉内膜增生中组织因子的表达;(7)抑制p50蛋白/敲除p50基因可以下调动脉增生内膜中E-selectin、VCAM-1的表达;(8)应用组织因子多克隆抗体阻断组织因子的活性可以减轻动脉内膜增生;(9)在人的动脉血栓中,NF-κB调控的目标基因也有高表达;(10)15uM穿心莲内酯不抑制细胞生长,无明显的细胞毒性。【结论】(1)本研究首次明确地证明了核因子-κB p50亚基可以与人组织因子启动子中的TF-κB位点结合,从而发挥对组织因子的调控作用;(2)利用荧光素酶报告基因实验,本研究证明了穿心莲内酯阻止了核因子-κB p50亚基与TF-κB位点的结合;(3)核因子-κB p50亚基对组织因子的调控在实验性动脉内膜增生中起着重要的作用;(4)核因子-κB p50亚基抑制剂——穿心莲内酯可以显著减缓实验性动脉内膜增生的进程。E-selectin、VCAM-1、组织因子的表达在穿心莲内酯治疗鼠中均有显著的下调;(5)靶向抑制核因子-κB p50亚基的小分子化合物穿心莲内酯经过进一步修饰有可能成为治疗血栓和炎症相关疾病的新药。总之,本研究不但首次在国际上首次系统而确切的证明了核因子-κB p50亚基可以调控组织因子的表达,而且初步证明了p50基因敲除或靶向抑制p50的小分子化合物穿心莲内酯可以下调组织因子的表达,并显著减缓实验性动脉内膜增生。本研究还揭示了通过干预NF-κB信号通路可以对组织因子相关的疾病病理进程进行干涉,靶向抑制核因子-κB p50亚基的小分子化和物在炎症和血栓相关的疾病中有着潜在的应用前景。