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单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes,S WNTs)是由单层石墨卷曲而成的一维管形碳纳米材料。SWNTs具备系列优越的光学、电学等理化性质,在纳米药物载体、近红外荧光成像、疾病诊断以及肿瘤光热治疗等生物医学方面的应用潜力很大,相关的研究是当前国际上重要的研究热点之一。近年来,人们在SWNTs的生物医学应用领域开展了大量的研究工作,取得了令人瞩目的研究成果。随着SWNTs在各个领域的广泛研究和应用,它的潜在生物毒性越来越受到人们的关注,研究人员从动物、细胞和分子水平上对其生物毒性进行了大量的实验研究。由于SWNTs属于超细微颗粒,易分散到大气环境中被呼吸道吸入,因此目前经气管滴注SWNTs引起的肺脏毒性作用及其机制的研究是其中最受关注和文献报道最多的。然而,无论作为药物载体,还是应用于体内近红外荧光成像进行疾病诊断,SWNTs的给药方式均以静脉注射为主。大量研究表明,SWNTs进入血液循环系统以后,主要积聚于肝、肾和肺。因此,研究静脉注射的SWNTs对肝、肾和肺的致纤维化等毒性作用,不仅能够为SWNTs的生物医学应用提供毒性依据,而且有助于进一步对SWNTs进行修饰以改善其生物兼容性。目的：1、评价尾静脉注射羧基化单壁碳纳米管(SWNT-COOH)对SD大鼠肝、肺和肾的致纤维化作用。2、利用荧光定量PCR研究SWNT-COOH诱导的大鼠肝纤维化作用的相关基因mRNA的表达。3、通过免疫组织化学实验进一步探讨SWNT-COOH诱导的大鼠肝纤维化作用相关蛋白的表达情况。4、评价尾静脉注射SWNT-COOH对大鼠肺脏和肾脏的致纤维化作用,研究相关蛋白的表达。方法：1、WNT-COOH的制备和动物实验前表征：依次以混合强酸(浓硝酸和浓硫酸)加热氧化、以超声振荡剪切SWNTs,制备在水中分散性良好的SWNT-COOH,经透析除杂、超滤浓缩和Co60-γ射线辐照消毒,备用。以透射电子显微镜(TEM)和激光纳米粒度分析仪(LPSA)分别观测和测定SWNT-COOH的形貌和粒径大小,以电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)检测SWNT-COOH分散液中的金属含量,以紫外-可见分光光度计(UV-Vis)测定SWNT-COOH的浓度。2、实验分组和周期设定：取SD大鼠96只,随机分为两组,即空白对照组和SWNT-COOH实验组,每组均为雌雄各半,尾静脉注谢给药；设定1月、2月、3月和4月共4个周期,其中4月周期为给药3个月后停药1个月。每天观察和记录大鼠的存活情况,每周称量一次大鼠的体重并做好记录。每个周期结束时,每组随机抽取12只大鼠、雌雄各半,共24只,麻醉解剖,采集标本。3. SWNT-COOH诱导的SD大鼠纤维化作用：采用苏木素-伊红染色法(HE染色法)评价SWNT-COOH引起的大鼠肝、肺、肾的病理变化；利用TEM观测和研究SWNT-COOH对大鼠肝脏细胞超微结构的影响。4、应用实时荧光定量PCR (qPCR)分别测试、分析空白对照组和SWNT-COOH给药组的大鼠肝组织中肝纤维化相关基因mRNA的表达情况：包括平滑肌激动蛋白α2 (ACTA-2)、转化生长因子-β (TGF-β)、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)等。5、应用免疫组织化学法分别检测、分析空白对照组和SWNT-COOH给药组的大鼠肝、肺、肾组织中肝纤维化相关蛋白的表达情况：包括平滑肌激动蛋白α2 (ACTA-2)、转化生长因子-β(TGF-β)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)的表达。结果：1、经氧化、剪切和纯化后,SWNT-COOH在水中具有较好的分散性,TEM观测和LPSA测试表明,SWNT-COOH的粒径分布比较均一,团聚较少；SWNT-COOH的Z均粒径为94.7nm,明显变短。ICP-OES测试结果表明,用于动物实验的SWNT-COOH样品的Fe、Co、 Al、Cr、Cu、Ni等金属含量均较低。2、与空白对照组相比,SWNT-COOH给药组的SD大鼠在2月周期死亡2只,4月周期时死亡1只,因此,给药组累积死亡3只,死亡的大鼠出现明显的腹部肿胀,解剖可见腹部积水。随着给药周期的增加,大鼠肝脏和肺脏黑染加深,大量SWNT-COOH在肝脏和肺脏沉积,停止给药1个月后,黑染变浅。3、大鼠肝脏切片经HE染色,在光学显微镜下观察可见SWNT-COOH给药组汇管区血管周围炎症细胞浸润,并伴随纤维化,并随给药周期增加而加剧,呈周期依赖性。大鼠肝脏切片的TEM结果表明,空白对照组细胞核仁明显,细胞器丰富,边缘清晰；而给药组细胞内线粒体受损,胞浆区出现大量空泡,溶酶体内可见SWNT-COOH,细胞间可观察到胶原纤维束。4、实时qPCR表明,与空白对照组相比,SWNT-COOH给药组的肝纤维化相关基因ACTA-2、TGF-p、 Col I和Col III的mRNA表达水平显著上调。5、免疫组织化学染色检测和分析结果表明,与空白对照组相比,SWNT-COOH给药组的大鼠肝脏、肺脏和肾脏等组织的纤维化相关蛋白ACT-2、TGF-β、Col Ⅰ. Col Ⅲ、MMP-2和TIMP-2蛋白表达均上调。结论：1、SWNT-COOH具有损伤大鼠肝、肺和肾等脏器组织,并诱导纤维化的生物毒性作用。2、其可能机制为,SWNT-COOH大量沉积于大鼠肝、肺和肾,被这些组织细胞吞噬,损伤线粒体和溶酶体,引发慢性炎症,上调纤维化相关基因和蛋白表达,导致纤维化的发生。