RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平上诱发的转录后基因沉默机制，该技术已经成为缺失功能基因筛选研究的强有力工具。另外，包括RNAi文库和微阵列的大规模RNAi技术已经成功用于低等生物和哺乳动物的表型筛选。RNAi筛选技术已经为功能基因组学研究、细胞信号传导解析和药物筛选带来了革命性变化。 病毒的复制离不开特定的宿主细胞，病毒通过与宿主细胞发生相互作用来获取自身复制的材料、能量和有利环境。因此研究病毒与宿主细胞间的相互作用机制，将为阐明病毒的致病机制和设计有效的抗病毒药物、疫苗提供线索。近年来研究表明，病毒对细胞凋亡的调控在病毒复制调节和致病性方面发挥重要作用，但其机制和意义大部分并不清楚，需要用新的思路和技术手段加以研究。 35型腺病毒（Adenovirus type 35，Ad35）属于腺病毒B亚群，仅感染免疫抑制病人（如：AIDS病人或器官移植受者）的泌尿系统，正常人群很少感染，所以在大多数人群中不会产生针对Ad35的中和抗体，这使得Ad35有可能作为一种新型的病毒载体应用于疫苗和基因治疗研发而备受青睐。但是对其复制机制及与宿主细胞相互作用机制研究还很少，对Ad35与哺乳动物细胞之间的相互作用及信号转导通路的深入研究将为Ad35作为新型病毒载体的开发利用打下基础。 为此，本文利用聚乙烯亚胺（PEI）介导的反向转染技术建立了一种较大规模的、适于一般实验室使用的RNAi筛选方法，并利用该方法建立的RNAi阵列对Ad35引起的细胞凋亡机制进行了初步研究，结果如下： 1．RNAi高效筛选方法的建立和凋亡相关基因siRNA阵列的构建 为了建立一种可适用于一般实验室、无须借助昂贵仪器设备的较大规模RNAi筛选技术，本研究首先对PEI介导的反向转染技术进行了研究。结果显示：PEI对细胞的毒性呈剂量依赖关系，当PEI与DNA的N／P=7.53，即PEI与DNA等量时，转染效率达到最高（达67.7％）。x<'2>检验显示，作为转染试剂，PEI与常用的脂质体（如商品化的Lipofectamine<'TM> 2000）的转染效率无显著差异（P>0.05）：PEI对小干扰RNA（siRNA）表达盒（SEC）的转染效率显著高于质粒载体（P<0.01）；反向转染的转染效率显著高于常规转染（P<0.01）。由于PEI价格远低于商品化脂质体，因此可以大大节省转染试剂费用。反向转染与常规转染不同，是预先将DNA用转染试剂固化到支持物上，转染时再加入细胞，因此便于大量制备和使用，适用于大规模筛选。 为了确证本研究建立的反向转染体系的效率和可靠性，分别检测了siRNA对细胞内稳定过表达的绿色荧光蛋白（GFP）基因和细胞内源性基因的抑制作用。利用PEI将表达GFP特异性siRNA的SEC反向转染可稳定表达GFP的Hela细胞株（Hela-EGFP），荧光显微镜观察和Western blot检测均表明可显著抑制其表达。同时细胞活性检测结果显示，针对凋亡相关基因Caspase 3和Bax的siRNA表达载体si-13和si-61能显著减少STS引起的HEK293细胞凋亡，Western blot检验结果显示si-13和si-61对靶基因Caspase 3和Bax表达有明显的抑制作用。这些数据提示，我们建立的PEI介导的反向转染技术具有经济、简便的特点，可用于大规模筛选需要。在此基础上，根据已发表序列，我们用pAVU6+27载体构建了63个表达siRNA的质粒，在96孔培养板上建立了阵列筛选模型。 2．35型腺病毒诱导细胞凋亡机制的初步研究 实验表明，Ad35感染Hela和HepⅡ细胞后，可诱发细胞核固缩，引起细胞DNA片断化，呈现典型的凋亡征象，并且这种凋亡是病毒复制相关和时间依赖的。 随后，利用本研究建立的RNAi筛选技术和构建的针对细胞凋亡通路的siRNA表达阵列或载体，通过Caspase 3活性检测、结晶紫染色、CCK-8细胞活性检测以及流式细胞术等检测方法，对Ad35引起的细胞凋亡的机制进行了初步研究。结果显示：抑制Caspase 3可以明显抑制细胞凋亡，说明Caspase家族在Ad35诱导的凋亡中发挥作用；分别抑制Caspase 8或Caspase 9，也可抑制细胞凋亡，提示线粒体途径和死亡受体途径均在Ad35诱导的凋亡中发挥作用。凋亡相关基 因siRNA阵列筛选结果表明，Caspase10、Caspase6、Caspase7、BID、Bcl-2、Cyt-C、Fas、TRAIL-R、IL-IR等基因在诱导细胞凋亡的信号传导中发挥作用。综合上述试验结果，本研究推测出了Ad35引起细胞凋亡的通路假说：Ad35感染细胞后，一方面刺激死亡受体（Death Receptor）如Fas、TRAIL-R、IL-IR等与死亡配体（Death Ligands）如Fas-L、TRAIL、IL-1等特异性结合，形成同源或异源三聚体，对FADD（Fas-associated death domain-containing protein）进行招募，然后FADD与pro-Caspase 8、pro-Caspase10的相应区域结合，活化Casapse8、Caspase10，最后激活Caspase3；另一方面，Ad35刺激线粒体释放细胞色素C（Cyt-C），并与Caspase9结合形成凋亡小体，从而激活Caspase9，然后Caspase9活化下游的执行因子Caspase7（或Caspase 3）。这样，通过上述两条途径激活Caspase7或Caspase3后，Caspase7直接执行细胞凋亡，Caspase3直接或通过激活caspase6执行细胞凋亡。但这一假说还需要进一步的实验验证。 本研究的实验结果也表明，结晶紫染色-ELISPOT检测、CCK-8检测与流式细胞术检测结果具有良好的一致性，因此可以组合用于与细胞活性有关的RNAi阵列筛选。 综上所述，本研究建立了一种经济、高效的、可适用于一般实验室、无须借助昂贵仪器设备的较大规模RNAi筛选技术，为大规模基因功能筛选、细胞信号传导通路解析和药物筛选提打下了基础。对于Ad35诱导细胞凋亡机制的研究，则为阐明其复制机制，开发更安全、高效的载体奠定了基础。