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2,3-丁二醇作为一种重要的生物化学品,广泛应用于化工、燃料、食品、航空航天等领域。乳清是乳制品行业的主要副产物,含有丰富的营养物质,在生产化工产品方面主要用于生产燃料乙醇。与生产燃料乙醇相比,2,3-丁二醇具有更高的产品附加值。阴沟肠杆菌CICC10011是目前用于生产2,3-丁二醇研究最多的菌株,其2,3-丁二醇的得率及最终产物浓度均很高,但利用乳糖发酵较慢；而肺炎克雷伯氏菌KG1虽然在2,3-丁二醇生成能力方面略次于10011,但其利用乳糖速度较快。本实验以KG1和10011为出发菌株,通过过表达乳糖代谢途径关键酶(乳糖通透酶和β-半乳糖苷酶),以期望提高菌株对乳糖的利用效率。主要内容和结果如下：(1)在KG1和10011菌株乳糖发酵培养基中添加p-半乳糖苷酶,比较不同添加量的p-半乳糖苷酶对菌株利用乳糖速度的影响。结果表明外源添加p-半乳糖苷酶可以加快KG1和10011利用乳糖的速度。(2)以KG1基因组为模板扩增β-半乳糖苷酶基因bgaB和乳糖通透酶基因lacY(记做KlacY),以E.coli MG1655基因组为模板扩增乳糖通透酶基因lacY(记做ElacY),将三个基因片段单独连接到表达载体pUC18K上,构建得到重组质粒,并分别转入KG1和10011中,得到重组菌株KG1/pUC18K-bgaB,KG1/pUC18K-ElacY, KG1/pUC18K-KlacY和10011/pUC18K-bgaB,10011/pUC18K-ElacY,10011/pUC18K-KlacY。(3)对KG1/pUC18K-bgaB,10011/pUC18K-bgaB进行SDS-PAGE分析和β-半乳糖苷酶活性的测定,KG1/pUC18K-bgaB的p-半乳糖苷酶活力是KGl的33.08倍；10011/pUC18K-bgaB的p-半乳糖苷酶活力是10011的3.45倍。乳糖发酵实验中,10011/pUC18K-bgaB菌株发酵时间缩短了12h,最大乳糖比消耗速率提高了38.70%,发酵终点2,3-丁二醇产量略高于原菌。KG1/pUC18K-bgaB菌株乳糖消耗速度变慢,发酵结束时,KG1/pUC18K-bgaB的残糖为41.03g/L。(4)乳糖通透酶活性的测定结果显示,KG1/pUC18K-ElacY酶活力是KGl的2.01倍,10011/pUC18K-ElacY酶活力是10011的1.75倍。乳糖发酵结果显示,KG1/pUC18K-ElacY,10011/pUC18K-ElacY和对应原菌相比,发酵速度分别提高了25.0%和12.5%,最大乳糖比消耗速率分别提高了66.2%和46.7%。说明ElacY基因的过量表达提高了两株基因工程菌对乳糖的利用速度,同时不影响2,3-丁二醇的生成量。(5)乳糖通透酶活性的测定结果显示,KG1/pUC18K-KlacY酶活力是KG1的1.92倍；10011/pUC18K-KlacY酶活力是10011的1.73倍。KG1/pUC18K-KlacY,10011/PUC18K-KlacY对乳糖的利用速度没有提高,2,3-丁二醇的生成量和原菌几乎相同。