论文部分内容阅读
背景伊立替康(CPT-11)为治疗转移性结直肠癌的一线用药,目前还广泛应用于小细胞肺癌,膀胱癌,脑肿瘤,乳腺癌,胃癌等实体瘤的治疗。每年超过60万的结直肠癌患者需要接受CPT-11的治疗,在这些化疗患者中有60～80%的患者会发生CPT-11诱发的腹泻,其中按照美国国家癌症研究所分级的重度腹泻的发生率为15～40%。这些威胁患者生命健康的重度腹泻严重影响了 CPT-11的临床应用。目前主要认为CPT-11导致的腹泻主要与其活性代谢产物SN38在肠道的暴露相关,机体内外排转运蛋白和药物代谢酶对SN38的体内处置决定了其在肠腔的暴露,从而影响了 CPT-11所致的肠毒性。大量的临床前研究和临床研究均针对于调节外排转运蛋白和药物代谢酶来降低SN38在肠道组织的暴露从而降低其肠毒性。但是CPT-11药物本身对SN38暴露相关的外排转运蛋白和代谢酶的影响,以及外排转运蛋白和代谢酶怎样调控SN38肠道暴露从而影响其毒性的研究不清楚。CPT-11导致的腹泻临床表现为大便呈稀溏便、水样便,严重时出现血便,同时伴有腹痛、乏力等,这些症状符合中医学中脾胃虚弱所致“下利”,“泄泻”的范畴,加之CPT-11化疗药物剧烈的细胞毒作用,CPT-11所致腹泻比普通的胃肠道疾病引起的腹泻更为严重,以至于出现便血。传统方剂小柴胡汤由柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、干姜、大枣等7味中药组成,前期临床调研发现其可降低CPT-11导致的血便。而且小柴胡汤保护胃肠道功能的作用强于临床上用于防治CPT-11所致的腹泻的小柴胡汤的加减方半夏泻心汤(TJ14)、黄芩汤(PHY906)和生姜泻心汤。因此本课题将从外排转运蛋白和代谢酶调控SN38肠道暴露角度出发研究CPT-11所致腹泻的机理以及中药复方小柴胡汤的干预作用。目的1 小柴胡汤及其主要成分与CPT-11联合用药对CPT-11抗肿瘤作用及其肠毒性的影响。2 CPT-11给药过程中对其体内处置相关的药物代谢酶和外排转运蛋白的影响,以及小柴胡汤和CPT-11联合用药是否能够诱导葡萄糖醛酸化转移酶(UGTs/Ugts)的表达和活力,减少活性代谢产物SN38肠道暴露从而降低其肠毒性。3 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein,BCRP)和多药耐药蛋白(Mutidrug Resistance Protein 2,MRP2)等外排转运蛋白对CPT-11所致腹泻的影响。方法1 用UHPLC-MS/MS分析小柴胡汤中主要成分的含量。2 采用皮下移植瘤裸鼠模型,研究不同剂量的小柴胡汤对CPT-11抗肿瘤作用及其肠毒性的影响。2.1小柴胡汤及其主要成分对CPT-11抗肿瘤作用及其肠毒性的影响。将HT-29荷瘤裸鼠随机分为6组,每组10只。对照组(灌胃水+i.p.生理盐水)、CPT-11组(50mg/kg)给药组(灌胃水+i.p.CPT-11)、小柴胡汤高、中、低剂量组(灌胃高剂量小柴胡汤3600mg/kg、中剂量900mg/kg、低剂量225mg/kg+i.p.CPT-11)、化合物组CPT-11(i.p.)+小柴胡汤中的主要成分。给药过程中每天观察并记录小鼠的肠毒性指数(体重,腹泻情况,血便的情况三者评分之和)。血便的检测采用粪便隐血检测试剂盒检测。9天后处死裸鼠,收集肿瘤、肠组织、血浆等样本。2.2血浆中炎性因子的检测 酶联免疫吸附法(ELISA)检测小柴胡汤联合给药组及 CPT-11 组中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2 和 IL-10 的表达。2.3小柴胡汤中防治CPT-11所致腹泻的活性成分筛选。分别筛选了小柴胡汤中的主要成分柴胡皂苷d、黄芩苷、汉黄芩素、甘草苷和姜酮对伊立替康所致腹泻FVB小鼠的肠毒性指数的影响。3小柴胡汤与CPT-11联合用药对小鼠肝脏和肠道组织中Cyps和Ugts蛋白含量和酶活力的影响。将FVB小鼠随机分为两组,CPT-11单独给药组每天给予FVB小鼠腹腔注射CPT-11 50mg/kg,连续6天造CPT-11所致的腹泻模型;小柴胡汤与CPT-11联合给药组预防性提前2天给予FVB小鼠小柴胡汤3.6g/kg到CPT-11给药结束;然后分别在0、2、4、6、8、9天时间点分别处死5只小鼠,收集肝脏和肠组织制作S9。3.1取CPT-11单独给药组和CPT-11与小柴胡汤联合用药组小鼠0、2、4、6、8、9天肝脏和肠的S9,非同位素标记液质联用(isotope Label-free UHPLC-MS/MS)法定量小柴胡汤与CPT-11联合用药过程中小鼠肝脏和肠道组织中Cyps和Ugts蛋白含量的变化。3.2底物探针法评价小柴胡汤与CPT-11联合用药对小鼠肝脏和肠道组织中Ugts酶活力的影响。3.3小柴胡汤联合用药对CPT-11、SN38和SN38-G组织分布的影响。FVB小鼠随机分为两组,CPT-11单独给药组每天给予FVB腹腔注射给药CPT-11 50mg/kg,连续6天造CPT-11所致的腹泻模型;小柴胡汤与CPT-11联合给药组预防性提前2天给予FVB小鼠小柴胡汤3.6g/kg到CPT-11给药结束;最后一次给药后分别在15min、1h、6h和24h四个时间点每组处死3只小鼠,收集小肠和结肠组织。LC-MS分析小肠和结肠中CPT-11、SN38和SN38-G的含量。4蛋白免疫印迹方法(Western-blot)分析小柴胡汤及其主要活性成分汉黄芩素和姜酮与CPT-11联合用药对Caco-2细胞中UGT1A1蛋白表达的影响。5蛋白免疫印迹方法(Western-blot)分析伊立替康给药对外排转运P-gp、Mrp2和Bcrp蛋白表达的影响6外排转运蛋白对CPT-11诱发肠毒性的影响。FVB野生型和Mdr1a(-/-)、Mrp2(-/-)和Bcrp1(-/-)雌性基因敲除小鼠腹腔注射给予CPT-11 50mg/kg连续给药6天造毒理腹泻模型,观察记录ITI。非同位素标记液质联用(isotope Label-free UHPLC-MS/MS)法定量CPT-11给药过程中FVB和Bcrp1(-/-)小鼠在0、2、4、6、9天肝脏和肠道组织中Cyps和Ugts蛋白含量的变化。结果1小柴胡汤与CPT-11联合用药可“保效减毒”。1.1小柴胡汤及其主要成分对CPT-11的抗肿瘤活性无显著性影响。与对照组相比,CPT-11组肿瘤抑制率从第二天的18.25%上升到第九天的67.81%。CPT-11与小柴胡汤联合用药高、中、低剂量组在第九天的肿瘤抑制率分别为55.58%、61.34%和71.83%,但联合用药组与CPT-11组之间无统计学差异。1.2小柴胡汤及其主要成分显著性降低了 CPT-11的肠毒性指数(Intestinal toxicity index,ITI)。小柴胡汤与CPT-11联合给药组与CPT-11组比可以显著性的降低CPT-11所致的ITI(4.10±0.99 vs 8.10±1.91)。小柴胡汤联合用药后小鼠的腹泻发生率从100%降低到20%,且无3-4级重度腹泻和血便的发生。小柴胡汤降低CPT-11所致的腹泻呈剂量依赖性,低剂量小柴胡汤组无效。汉黄芩素、黄芩苷为小柴胡汤中防治伊立替康所致腹泻的主要活性成分,但是汉黄芩素和姜酮配比组降低ITI最显著(ITI,3.2 ±0.19)。病理学检查表明小柴胡汤降低了 CPT-11对胃肠道的损伤。1.3小柴胡汤及其主要成分可以降低CPT-11所致的炎症。在CPT-11所致腹泻模型中,FVB中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6显著性升高,小柴胡汤及其主要成分黄芩素、汉黄芩素通过降低血浆和组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-2的表达而降低CPT-11所致的炎性损伤。1.4小柴胡汤联合用药可以显著降低了 SN38和CPT-11在小肠和结肠的暴露,而且增加了小肠中SN38-G的含量。小柴胡汤联合用药CPT-11及其代谢物在吸收相15min、分布相1h、代谢相6h和消除相24h各组织中的的浓度结果表明:小柴胡汤联合用药组24h回肠组织中的CPT-11和SN38含量比CPT-11组分别下降了 71.7和88.3%,而且小柴胡汤显著提升了回肠中SN38-G含量1.65～2倍在1h和6h。2.CPT-11选择性损伤了小肠中Ugts酶表达,小柴胡汤联合用药显著性降低CPT-11对肠道Ugts酶表达的损伤而降低其毒性。CPT-11连续给药后,FVB肠组织中Ugt1a1含量下降了 6倍、Ugt1a6a下降了 10倍、Ugt1a7c下降了 10倍、Ugt1a9低于定量下限、Ugt2a35下降了 2.3倍。小柴胡汤显著性的诱导小肠中Ugt1a1蛋白表达上调了 2.5倍。小柴胡汤与CPT-11联合用药可以显著性降低CPT-11对肠道Ugts表达的损伤而降低其毒性。而联合用药对肝脏中Ugts酶表达未发生显著性的变化,同样CPT-11对肝脏和肠组织的Cyps的蛋白含量无显著性影响。3小柴胡汤及其主要活性成分汉黄芩素和姜酮与CPT-11联合用药显著上调了 Caco-2中UGT1A1蛋白表达1.5～1.9倍,且黄芩素和姜酮组存在剂量依赖性。4小柴胡汤与CPT-11联合用药对小鼠肝脏和肠道中Ugts催化活力的影响。4.1 CPT-11连续给药显著性的降低了 Ugt1a1和Ugt1a9的催化活力。结果表明连续腹腔注射CPT-11 6天后,肠道细胞的Ugt1a1对特异性底物雌二醇和Ugt1a9底物异丙酚的催化活力逐渐减低,在第四天的时候降低到最低值,持续到第九天。肠道中SN38的葡萄糖醛酸化速率从200 pmol/mg/min降低至1.04± 0.08～2.36± 0.07 pmol/mg/min,降低了 80倍。但是肝脏中的SN38的葡萄糖醛酸化速率的变化没有统计学差异。CPT-11所致的腹泻发生于第六天,持续到第九天。因此推测Ugts的活力可以作为特征性的指标用于预测腹泻的发生。4.2小柴胡汤预防给药显著性的提高肠道Ugts的催化活力。小柴胡汤联合用药组的SN38催化活力也显著性的从800pmol/mg/min降低到200pmol/mg/min在第四天,但是可以维持到到第六天(>100pmol/mg/min),而且在第九天恢复到正常水平。虽然小柴胡汤无法阻止SN38对肠道细胞的损伤以及UGTs酶的破坏,但是小柴胡汤可以显著性诱导Ugts的表达,从而降低CPT-11对肠道细胞的杀伤作用。Ugts酶的表达和活力的相关性分析结果表明,肠S9中的Ugts的蛋白表达水平与肠道组织中的总蛋白水平无关,与各Ugt亚型的酶活力相关,但是酶的催化活力与Ugts的总的蛋白水平的相关性要高于各自对应的酶亚型与特异性底物的催化活力(Ugts=Ugt1a1+Ugt1a6a+Ugt1a7c+Ugt1a9)。说明在小鼠肠道组织中,SN38的代谢灭活需要Ugt多种酶亚型的共同参与,但是与Ugt1a6亚型的相关性最高(R2=0.626)。5 P-gp、Mrp2和Bcrp外排转运蛋白的缺失显著性的改变了 CPT-11的体内处置而影响了其毒性。Bcrp的缺失显著的增加了 CPT-11和SN38的肠和血浆的暴露而增加其肠毒性。Spearman相关性分析结果表明,SN38的稳态肠组织浓度(Css)与CPT-11所致的毒性正相关(R2=0.667,P<0.001),而且相关性要高于SN38血浆AUC与CPT-11所致的毒性的相关性(R2=0.521,P<0.001)。因此临床上与Bcrp相互作用的中药和西药与CPT-11联合用药的时候,要密切关注CPT-11肠毒性的变化。显然本研究需要进一步调查评估ABCG2变异基因型与CPT-11诱导的腹泻之间的关系。但是P-gp和MRP2的缺失与背景鼠FVB的肠毒性比无统计学差异。6 CPT-11选择性损伤了Bcrp1(-/-)基因敲除小鼠小肠中Ugts酶表达。Bcrp1(-/-)基因敲除小鼠小肠中Ugt1a1、Ugt1a6a、Ugt1a7c、Ugt1a9蛋白含量也分别下降了 2～7倍。但是FVB和Bcrp1(-/-)基因敲除小鼠在day6的Ugts酶的含量无统计学差异。Bcrp外排转运蛋白的缺失和CPT-11对Bcrp1(-/-)小鼠肠道导致UGTs酶的损伤两者共同作用导致Bcrp1(-/-)基因敲除小鼠的肠毒性显著性高于背景鼠FVB。结论小柴胡汤与CPT-11联合用药可“保效减毒”。小柴胡汤及其主要成分黄芩苷和汉黄芩素可以有效治疗CPT-11导致腹泻而不影响其抗肿瘤的活力。CPT-11所致的肠毒性与其体内处置相关的外排转运蛋白(P-gp、Mrp2和Bcrp)和UGTs酶相关。Bcrp外排转运蛋白对CPT-11的活性代谢产物SN38的体内处置中占有非常重要的地位,其功能的缺失会导致组织和血浆中SN38的暴露量的增加而增加CPT-11的肠毒性。CPT-11选择性损伤了小肠中Ugts蛋白表达和催化活力诱发了与SN38肠局部暴露密切相关的腹泻,小柴胡汤联合用药通过上调了肠道UGTs酶对SN38的灭活从而降低了 SN38导致的腹泻。外排转运蛋白的缺失和CPT-11导致小肠中UGTs酶的损伤两者共同作用可加重CPT-11所致的肠毒性。本研究为临床上小柴胡汤和CPT-11的联合用药提供了理论和实践依据。