论文部分内容阅读
类器官是体外培养与来源器官相似的组织,它能够在体外保持原始干细胞功能,通过不断生长、分化后这些组织的基因、结构和功能仍然与来源器官类似。类器官是当前生物学研究的热点之一,已在疾病机理研究、药物筛选、再生医学、生物材料研究等方面展示了重要应用前景。本论文利用制备的多孔聚乳酸生物材料为基质进行小肠类器官的培养研究,得到的研究结论如下:首先,本研究制备了蔗糖致孔剂,该致孔剂性质稳定,形状规则,易于去除,其粒径分布范围可由338.01μm±74.79μm增大至1124.29μm±228.04μm。将致孔剂在60℃下加热0-60 min后,致孔剂可逐渐融化产生黏连并形成致孔模板。利用“溶剂浇筑-分子沥滤法”制备了多孔海绵状PLA支架材料,经热场发射扫描电镜(SEM)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、热重分析(TG)等对支架材料分析,结果表明PLA支架孔径圆润,孔隙率>94%,支架中的孔径尺度可由致孔剂进行调控,其连接孔可由19.02μm±4.86μm增加至265.13μm±22.05μm。其次,选用Caco-2细胞模型在2 D细胞水平对所制备的多孔PLA材料的生物相容性进行检测。制备的PLA材料能够为Caco-2细胞提供贴附及生长位点,其孔洞结构也能够满足细胞生长所需,同时Caco-2细胞在PLA材料内外的生物学结构与形态均保持清晰且完整,并能够继续增殖。支架中Caco-2细胞的细胞核大小平均值为19.53μm±2.09μm,与对照组平均尺寸(17.92μm±2.17μm)较为接近,并且细胞均表现为相似的紧密排列状。MTT结果显示,多孔海绵状PLA支架在Caco-2细胞水平表现的毒性较低,生物相容性优良,细胞相对增殖率均>90%。然后,提取小肠隐窝,体外培养小肠类器官。所培养的类器官可由球状隐窝形态向类似绒毛状转变并逐渐形成空腔,经历“出芽”生长分化为复杂的高级器官结构。最后,将培养的小肠类器官接种于PLA支架中,通过SEM、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜(CLSM)等观察类器官的生长状态,通过细胞核/细胞骨架染色、活/死染色、HE染色等技术检测小肠类器官在PLA支架中的增殖分化情况。结果表明,小肠类器官接种于多孔海绵状PLA支架后,其生长、分化及增殖状态良好,能够保持完整的轮廓、核型、骨架等生物特征。其直径可在一周内由100μm以下增加2-4倍,最大直径可超过400μm。同时,因所制支架的孔洞丰富且相互连通,满足了小肠类器官的生长迁移条件,并且该支架对小肠类器官生物相容性良好,相对增殖率>70%并保持持续增长趋势。多孔PLA支架中小肠类器官生长良好,类器官与PLA材料紧密结合,并能发生迁移,表明PLA生物材料有望用作类器官培养的载体平台用于组织修复、再生医学、疾病生理学等领域的研究。