第一部分十二指肠空肠旁路术后大鼠心肌葡萄糖摄取的变化及其在糖尿病心肌病改善中的作用研究背景2017年全球糖尿病患者总数已经达到4.25亿,预计至2045年将突破6.29亿。糖尿病已经成为亟待解决的全球公共健康问题,其中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)最为常见。中国的T2DM患病率在过去20多年间呈现爆炸性增长,传统治疗方法对血糖的控制不甚理想,需进一步探索更加有效的治疗方案。减重手术(Bariatric surgery)最初的目的是治疗病态肥胖。但减重术后的患者在体重下降的同时,其T2DM及相关代谢并发症也得到改善。自此,针对减重手术治疗T2DM的基础和临床研究陆续开展。目前,减重手术作为一种成熟的治疗方法在越来越多的地区得到广泛应用。减重手术已被证实可以迅速、有效、持久地改善T2DM及其相关并发症。糖尿病心肌病是糖尿病的主要心脏并发症之一,是指发生于糖尿病患者但不能用动脉高压和冠状动脉粥样硬化性心脏病解释的心肌病变。糖尿病心肌病早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张期功能不全,晚期则出现心肌收缩和舒张功能障碍。糖尿病心肌病可以显著增加心脏衰竭和心源性休克的风险,但目前临床上尚无特异性的治疗方法。心肌胰岛素抵抗及其导致的心肌葡萄糖摄取障碍是糖尿病心肌病的重要病理生理机制,纠正心肌能量摄取障碍和代谢紊乱则可以改善甚至逆转糖尿病心肌病。心肌细胞葡萄糖的摄取主要依赖跨膜葡萄糖浓度梯度以及细胞表面葡萄糖转运体(Glucose transporter,GLUT)的数量。GLUT-1主要位于心肌细胞膜并介导基础状态(无胰岛素或运动刺激)下的心肌葡萄糖摄取。当存在胰岛素刺激时,心肌细胞内的GLUT-4转位到细胞膜进而显著增加心肌的葡萄糖摄取能力。GLUT-4的细胞内转位过程主要涉及GLUT-4运输囊泡的形成、囊泡转运、运输囊泡与细胞膜的锚定融合等。研究表明减重手术可以有效缓解糖尿病心肌病,但机制尚不十分明确。探究减重手术不依赖于体重下降的改善糖尿病心肌病的作用及相关机制成为亟待解决的问题。十二指肠空肠旁路术(Duodenal-Jejunal bypass,DJB)作为一种研究减重手术不依赖于体重下降的抗糖尿病作用的实验手术模型在基础研究中被广泛应用,但DJB术后心肌葡萄糖摄取的变化及其对糖尿病心肌病的影响尚未见报道。研究目的本研究旨在通过高脂喂养联合低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建糖尿病大鼠模型并进一步诱导糖尿病心肌病。随后对造模成功大鼠分别实施假手术(Sham surgery)和DJB手术,并以正常大鼠作为空白对照。通过一系列形态学、功能学检测以及分子生物学实验,明确DJB术后大鼠心肌葡萄糖摄取的变化及相关机制,以及上述变化对糖尿病心肌病的作用。研究方法1.本研究通过高脂喂养(持续4周)联合低剂量STZ腹腔注射(35mg/kg)构建糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠造模成功16周后,以同期普通饮食喂养的正常大鼠作为对照(Control组),进行如下检测以评价糖尿病心肌病大鼠模型的有效性:(1)测定对照组大鼠和糖尿病大鼠的体重、尿量、血压等一般情况;(2)依托经胸心脏超声评估大鼠心脏功能。2.在确认上述动物模型有效的前提下,糖尿病心肌病大鼠被随机分为假手术组(Sham组)和DJB组,并分别实施相应手术,继续以对照组作为正常对照。术后进行下列分析与检测:(1)动态监测各组大鼠体重、摄食量、糖代谢相关指标(空腹血糖、糖耐量、空腹胰岛素等);(2)综合HE染色、Masson染色、油红O染色、透射电镜等一系列组织形态学检测,评估各组大鼠的心肌重构;(3)依靠经胸心脏超声结合血流动力学分析,评估各组大鼠心脏功能;(4)通过以氟代脱氧葡萄糖(Fluorine-18 labelled fluorodeoxyglucose,18F-FDG)作为核素示踪剂的正电子发射计算机断层显像(Positron emission tomography,PET),在体评估各组大鼠的心肌葡萄糖摄取能力;(5)检测各组大鼠心肌GLUTs的表达水平,明确DJB术后大鼠心肌葡萄糖摄取发生变化的原因;(6)检测各组大鼠心肌胰岛素信号通路以及GLUT-4转位相关调节蛋白的表达,进一步揭示DJB术后大鼠心肌葡萄糖摄取发生变化的潜在机制。研究结果1.糖尿病大鼠成模16周后(即手术前),糖尿病组大鼠每日饮水量及尿量均显著高于正常组(P均<0.01)。两组大鼠血压水平未见显著差异(P均>0.05)。心脏超声结果提示糖尿病组大鼠心脏收缩及舒张功能均有显著受损。上述结果证实本研究中的糖尿病心肌病大鼠模型可靠且有效。2.由于围手术期禁食以及手术应激的影响,DJB组和Sham组大鼠术后第一周均出现明显的体重和摄食量下降,随后逐渐恢复。DJB组和Sham组大鼠体重和摄食量在术后各个观测时间点均未见显著差异(P均>0.05)。3.DJB组大鼠术后糖代谢得到显著改善:术后2、4、6、8周,DJB组大鼠空腹血糖水平均显著低于Sham组(P均<0.01)。DJB组和Sham组大鼠在术后各个观测时间点空腹血清胰岛素水平均未见显著差异(P均>0.05),但DJB组大鼠的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著低于Sham组(P均<0.01)。同时,术后2、8周DJB组大鼠口服糖耐量试验的曲线下面积(AUCoc TT)均显著低于Sham组(P均<0.01)。此外,术后2、8周,DJB组大鼠血清胰高血糖样肽-1(GPL-1)水平显著高于Sham组(P均<0.01)。4.DJB组大鼠术后心肌重构得到显著缓解:与Sham组相比,DJB组大鼠心肌细胞肥大、心肌脂质沉积、心肌纤维化以及心肌超微结构紊乱均得到显著缓解。5.DJB组大鼠术后心脏功能得到显著改善:术后8周,DJB组大鼠心肌左室射血分数(EF)和短轴缩短分数(FS)均显著高于Sham组(P均<0.01)。同时,DJB组二尖瓣舒张早期血流峰速度/二尖瓣环舒张早期运动峰速度(E/e’)显著低于Sham组(P<0.01)。此外,DJB组大鼠术后左室舒张末期压力显著低于Sham组(P<0.01)。即DJB组大鼠左室舒张和收缩功能较Sham组均有显著改善。6.18F-FDG PET扫描结果显示DJB组大鼠术后空腹以及葡萄糖负荷后的心肌标准吸收值均显著高于Sham组(P均<0.01)。7.DJB组大鼠术后心肌GLUT-4细胞内转位增加:三组大鼠术后心肌GLUT-1和GLUT-4的总蛋白表达水平均未见显著差异(P均>0.05)。三组大鼠心肌细胞膜GLUT-1表达水平未见显著差异(P>0.05),但DJB组大鼠术后心肌细胞膜GLUT-4表达较Sham组显著上调(P<0.01)。8.DJB组大鼠术后心肌GLUT-4细胞内转位增加的机制分析:(1)DJB组大鼠术后心肌胰岛素敏感性显著改善,其胰岛素受体底物1(IRS1)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/AKT)的磷酸化水平较Sham组均显著增强(前者P<0.05,后两者P<0.01)。(2)DJB组大鼠心肌AKT底物蛋白160(AS160)以及TBCl域家族成员1(TBClD1)的磷酸化水平较Sham组显著增强(P均<0.01)。三组大鼠术后心肌囊泡相关膜蛋白2(VAMP2)、突触小体相关的蛋白23(SNAP23)以及Syntaxin4表达水平未见显著差异(P均>0.05)。结论DJB可以从形态学及功能学上显著缓解大鼠的糖尿病心肌病,术后心肌细胞GLUT-4转位增加及其导致的心肌葡萄糖摄取改善在其中发挥重要作用。第二部分心肌钙稳态和细胞自噬在减重手术后糖尿病心肌病改善中的作用及机制分析研究背景糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率逐年上升,在给病患个体带来精神及肉体损害的同时,还给国家和个人带来沉重的经济负担。除了血糖异常本身之外,持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官损害及功能障碍,引起严重的并发症。糖尿病心肌病是较为严重的一种心脏并发症,可以显著增加心脏衰竭和心源性休克、猝死的风险。目前临床上尚缺乏特异性的治疗方法。减重手术的设计初衷是病态肥胖的治疗。随后的临床研究证实,该手术可以迅速、有效、持久地改善T2DM及相关并发症。近期有研究报道,减重手术可以有效缓解糖尿病心肌功能障碍,且上述作用不依赖于体重下降或者饮食改变。这无疑为糖尿病心肌病的治疗提供了新的方向和可能。然而,减重手术治疗糖尿病心肌功能障碍的相关机制口前仍不明确。糖尿病心肌病的发生发展涉及多种病理生理因素。心肌细胞的兴奋-收缩偶联依赖于细胞内钙离子水平的波动。心肌细胞内钙稳态失调是心脏功能障碍的重要诱发因素。到目前为止,减重手术对于心肌钙稳态的作用尚未见相关报道。我们的前期研究显示减重手术可以显著改善糖尿病心肌病大鼠的心肌肌浆网应激。鉴于肌浆网是心肌细胞内钙离子的主要贮存场所,同时肌浆网应激的改善对于恢复钙稳态具有极大的促进作用,我们提出如下假说:减重手术缓解糖尿病心肌病可能与其改善心肌钙稳态密切相关。心肌细胞自噬也与糖尿病心肌病的发生发展密切相关。自噬本身作为一种保护机制有助于细胞存活。然而,自噬的失调或失控往往导致严重的后果。既往的研究对于心肌细胞自噬在T2DM状态下如何变化尚存在较大争议,而减重手术对于心肌自噬的作用及相关机制尚未见报道,亟待进一步研究。研究目的本研究旨在通过高脂喂养联合低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建糖尿病大鼠模型并进一步诱导糖尿病心肌病。随后对糖尿病心肌病大鼠实施减重手术,进而通过一系列形态学、功能学检测以及分子生物学实验,明确减重手术后大鼠心肌钙稳态和心肌细胞自噬的变化及其对糖尿病心肌病的作用,并对相关机制进行阐明。研究方法本研究通过高脂喂养(持续4周)联合低剂量STZ腹腔注射(35mg/kg)构建糖尿病大鼠模型并进一步诱导糖尿病心肌病。造模成功大鼠随后被随机分为假手术组(SHAM组)、袖状胃切除术(Sleeve gastrectomy,SG)组和十二指肠-空肠旁路术(Duodenal-Jejunal bypass,DJB)组,并分别实施相应手术。术后进行下列分析与检测:1.动态监测各组大鼠空腹血糖、糖耐量、空腹胰岛素等糖代谢相关指标;2.通过HE染色、Masson染色、油红O染色等一系列组织形态学检测评估大鼠心肌重构;3.依靠经胸心脏超声结合血流动力学分析评估大鼠心脏功能;4.以Fura-2/AM作为Ca2+荧光探针检测大鼠分离心肌细胞的钙瞬变,同时结合心肌Ca2+通道蛋白及相关调节蛋白的定量分析明确减重手术后大鼠心肌钙稳态的变化及相关机制;5.分别检测正常情况下以及氯喹干扰后大鼠心肌自噬相关蛋白的表达,明确减重手术后大鼠心肌细胞自噬流的变化及相关机制。研究结果1.术后4周及16周,三组大鼠心率及血压均未见显著差异(P均>0.05)。SG组和DJB组大鼠尿量均显著低于SHAM组(P均<0.01)。术后16周,SG组和DJB组大鼠心脏重量显著低于SHAM组(前者P<0.05;后者P<0.01)。2.SG组和DJB组大鼠术后糖代谢得到显著改善:术后2、4、8、12、16周,SG组和DJB组大鼠空腹血糖水平均显著低于SHAM组大鼠(P均<0.01)。三组大鼠空腹血清胰岛素水平未见显著差异(P>0.05),但SG组和DJB组大鼠的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)均显著低于SHAM组大鼠(P均<0.01)。此外,口服糖耐量实验(OGTT)表明SG组和DJB组大鼠术后糖耐量得到显著改善。3.SG组和DJB组大鼠术后心脏功能得到显著改善:术后16周,SG组和DJB组大鼠心肌舒张功能和收缩功能均较SHAM组大鼠显著改善。SG组和DJB组大鼠术后左室舒张末期压力均显著低于SHAM组大鼠(P均<0.01)。此外,SG组和DJB组大鼠术后血清脑钠肽(BNP)水平均显著低于SHAM组大鼠(P均<0.01)。4.SG组和DJB组大鼠术后心肌重构得到显著缓解:SG组和DJB组大鼠心肌细胞面积较SHAM组显著降低(P均<0.01)。此外,SG组和DJB组大鼠心肌脂质沉积及心肌纤维化均得到显著改善。5.SG组和DJB组大鼠术后心肌钙稳态显著改善:SG组和DJB组大鼠术后分离心肌细胞钙瞬变的峰值升高、恢复加快、时程缩短。上述变化与两组大鼠术后心肌Ⅱ型Ryanodine受体(RyR2)、肌浆网钙泵2a(SERCA2a)、FK506结合蛋白12.6(FKBP12.6)表达上调以及磷酸受钙蛋白(PLB)的磷酸化水平升高相关。6.SG组和DJB组大鼠术后心肌细胞自噬受到抑制:与SHAM组大鼠相比,SG组和DJB组大鼠术后心肌自噬小体数量显著下降(P均<0.01)。此外,两组大鼠术后心肌自噬微管蛋白轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)表达下降,而p62表达显著增加,且无法被氯喹逆转。SG组和DJB组大鼠心肌细胞自噬的上述改变与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活以及AMP激活的蛋白激酶(AMPK)通路抑制密切相关。结论减重手术可以从形态学及功能学上显著改善大鼠的糖尿病心肌病,术后心肌钙稳态的改善以及心肌细胞自噬的抑制在其中发挥重要作用。