目的:曲妥珠单抗(赫赛汀®)是一种对HER2阳性乳腺癌十分有效的治疗方法,而耐药成为阻碍其应用的难点。自然杀伤(natural killer,NK)细胞是先天免疫的重要组成部分,并且是曲妥珠单抗诱导ADCC效应最有效的细胞。为了增强对曲妥珠单抗耐药乳腺癌的杀伤作用,本实验将曲妥珠单抗与NK细胞联合来杀伤耐药的乳腺癌细胞,同时检测相互作用的机制。方法:1.用MTT法验证耐药细胞的耐药性,同时验证曲妥珠单抗对NK细胞无增殖抑制作用。2.钙黄绿素-AM释放法检测NK细胞联合曲妥珠单抗对敏感及耐药乳腺癌细胞的协同杀伤作用,同时对比阻断Fas受体前后,两者联合杀伤的变化情况。3.流式细胞术分别检测敏感及耐药肿瘤细胞表面HER2的表达变化情况;分别检测了不同处理组NK细胞表面活化性受体NKp44、NKp46、NKG2D,抑制性受体KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1,凋亡配体Fas L的表达变化;NK细胞内部穿孔素及颗粒酶B的生成量;肿瘤细胞表面活化性配体ULBP1、ULBP2、MICA及凋亡受体Fas的表达情况;NK细胞在各实验组分泌至上清中的CCL5、IL13。4.ELISA法用于检测NK细胞在各实验组分泌至上清的IFN-α及TNF-β的生成量的变化情况。结果:1曲妥珠单抗耐药细胞的耐药性持续存在,耐药细胞表面HER2表达量明显降低。2曲妥珠单抗与NK细胞对耐药细胞单独杀伤作用均不明显,但联合后对耐药细胞的杀伤作用显著增强,且联合杀伤率随效靶比的增加而增加。进一步研究两者联合作用机制发现:曲妥珠单抗与NK细胞联合作用于肿瘤细胞后,肿瘤细胞表面的活化性配体ULBP1、ULBP2、MICA、NK细胞表面活化性受体NKp44的表达量显著增加,抑制性受体KIR2DL1,KIR2DL2,KIR2DL3及KIR3DL1的表达量明显降低;共培养环境中NK细胞相关细胞因子IFN-γ、TNF-β、CCL5、IL13均明显增加;NK细胞相关的凋亡受配体Fas及Fas L的表达被显著上调,阻断Fas受体后,联合杀伤作用明显减弱,协同作用减弱甚至消失;NK细胞内部穿孔素及颗粒酶由于其基础表达量极高,故生成量没有显著变化。结论:1.SKBR3-pool2、BT474-HR20表面的HER2表达量降低可能是其耐药的原因之一。2.HER2表达量降低不影响曲妥珠单抗介导NK细胞的ADCC效应,同时随着NK细胞效靶比的增加,协同作用增强。3.在肿瘤细胞的环境中,曲妥珠单抗能够通过以下几个方面影响NK细胞:1增加NK细胞活化性受体、活化性配体,并降低NK细胞抑制性受体的表达量来增加NK细胞的活性;2增加NK细胞的细胞因子增强NK细胞的杀伤能力;3增加NK细胞凋亡受配体Fas及Fas L的表达增强NK细胞的杀伤能力。