本课题主要目的：　　 急性肺损伤导致弥漫性的肺血管内皮，肺上皮损伤和肺泡毛细血管通透性增加。最近的研究表明外周血来源的内皮祖细胞(EPCs)移植治疗在维持正常内皮细胞功能和修复损伤内皮细胞中发挥重要的作用。本研究的目的是评估自体外周血来源的内皮祖细胞移植对油酸和内毒素急性肺损伤的保护效应和可能的潜在作用机制。本实验第一部份旨在从兔外周血分离单个核细胞，在体外定向培养下使其向内皮祖细胞分化和扩增。同时，通过内皮祖细胞特有细胞表面标志物，以及其特异性的吞噬低密度脂蛋白和特异性结合荆豆凝集素特点来鉴定培养的内皮祖细胞。本研究第二和第三部份分别采用油酸和内毒素静注建立油酸兔急性肺损伤和内毒素急性肺损伤模型，通过评估移植自体血来源的内皮祖细胞对急性肺损伤的修复效应来分析其对急性肺损伤可能的保护机制。本研究第四部份通过转染hVEGF165基因到内皮祖细胞，探讨hVEGF165基因转染内皮祖细胞对其在体外粘附，迁移及增殖能力的影响，从而为体内移植转hVEGF165基因的内皮祖细胞奠定实验基础。　　 本课题主要方法：　　 1.采用Fi col l 密度梯度离心法成功分离，培养，扩增和鉴定兔外周血来源的内皮祖细胞成年雄性新西兰大白兔，全身麻醉后经耳中央动脉采血10ml/ kg，利用Fi col l 密度梯度离心法分离出单个核细胞，在体外定向培养基下进行培养，使其向内皮祖细胞方向分化，同时在体外扩增。利用内皮祖细胞特有的细胞表面标志物VEGFR2、CD133和CD34，采用免疫荧光和免疫组化进行内皮祖细胞鉴定。　　 通过内皮祖细胞吞噬低密度脂蛋白和特异性结合荆豆凝集素特点，采用免疫荧光来证实内皮祖细胞。　　 2.采用油酸静脉注射建立兔急性肺损伤模型，用自体内皮祖细胞移植评价其对急性肺损伤的治疗效果成年雄性新西兰大白兔经静注戊巴比妥钠麻醉后，80mg/ kg油酸右耳缘静脉缓注。4小时后，EPCs 移植组从耳缘静脉注射CM-Di l 荧光标记的EPCs(200ml 生理盐水含大约106个细胞)，对照组注射等量生理盐水。各组动物分别于油酸处理前、油酸处理后各个时间点，进行动脉血气分析并计算PaO2/ Fi O2比值。各组动物分别于油酸处理前、油酸处理后各个时间点，ELISA 法检测血清VEGF 含量。48小时后处死动物，取双肺组织标本进行病理检测，评价肺含水量和肺组织多形核白细胞浸润情况，计算肺透明膜和出血面积。　　 3.采用内毒素静脉注射建立兔急性肺损伤模型，用自体内皮祖细胞移植评价其对急性肺损伤的治疗效果及探讨可能的机制新西兰大白兔经耳缘静脉注射苯巴比妥钠麻醉后，通过耳静脉缓慢（超过30分钟）注射内毒素500mg/ kg 制备兔急性肺损伤模型。内毒素注射4h后，实验组静注500ml 生理盐水含自体内皮祖细胞(约106)，对照组给予同等量生理盐水静脉注射。观察各组动物血气，肺组织病理改变，检测血浆NO、MDA 含量和SOD活性，West ern bl ot 检测肺组织I NOS和VEGF表达情况，ELISA法分析血浆细胞因子IL-1β， E-sel ect I n, ICAM-1和IL-10在损伤肺组织的表达水平。　　 4．采用人hVEGF165基因转染内皮祖细胞，在体外细胞水平研究基因修饰对内皮祖细胞移植粘附，迁移和增殖的影响构建人hVEGF165基因真核表达载体，基因修饰内皮祖细胞，在体外检测hVEGF165基因转染对内皮祖细胞粘附，迁移和增殖能力的影响。　　 本课题主要结果：　　 1.本实验采用了一种简单实用的方法从兔外周血中分离、诱导、并能在体外成功培养、扩增出具有典型特征的EPCs。本实验采用综合方法成功鉴定了EPCs，首先从形态学上，培养7天后细胞呈典型内皮祖细胞集落；其次, 我们采用免疫细胞化验证了内皮祖细胞特有的表面标记物CD34、VEGFR2和CD133，同时利用内皮祖细胞内吞ac-LDL的功能及特异性结合UEA-1的特点，采用细胞荧光化学方法证实从外周血能成功分离和培养出自体EPCs。　　 2.本研究结果表明：油酸急性肺损伤早期PaO2/ Fi O2比值均显著降低，自体EPCs 移植后，PaO2/ Fi O2比值逐渐升高，肺功能有明显改善。急性肺损伤期间，肺血管内皮细胞激活，表达粘附分子和趋化大量PMNs的浸润，肺泡-毛细胞血管膜破坏，蛋白渗透性增加，透明膜形成和肺出血。本实验结果显示，自体EPCs 移植后，兔肺含水量明显降低，肺透明膜面积和出血面积显著减少，PMN 率计算显示肺组织PMN 浸润数量也明显减少。本研究也探讨了EPCs 移植后兔血清VEGF 含量的变化，与对照组比较，EPCs组血清VEGF 含量在移植后逐渐升高，验证了EPCs 除了直接的细胞补丁效应外，还能分泌VEGF等细胞因子，通过旁分泌的方式刺激损伤周围内皮细胞自我修复和再生。本研究利用荧光示踪技术追踪和定位了EPCs在肺血管壁的归巢和整合，表明EPC 静脉注射后到损伤的肺血管内皮参与修复和重建。　　 3.本研究结果表明内毒素急性肺损伤后，PaO2/ Fi O2比值均显著降低，EPCs 移植输注后能明显增加其比值。与生理盐水对照组比较，自体EPCs 移植后能明显降低多形核白细胞在肺组织的浸润数量，肺水含量和透明膜形成面积和肺出血面积也显著减少。　　 血浆NO和MDA的含量明显减少，SOD 活性却显著增强。在损伤肺组织，自体EPCs 处理后，致炎因子IL-1β， E-sel ect I n和ICAM-1表达水平明显降低，而抗炎细胞因子IL-10表达水平却明显增加。　　 同时，EPCs 移植治疗后，损伤肺组织VEGF的表达水平明显增加，而I NOS表达水平却降低。　　 4．hVEGF165基因在体外能成功转染内皮祖细胞，转染的EPCs能表达VEGF蛋白，hVEGF165基因转染内皮祖细胞后能明显促进其增殖、迁移和粘附能力。　　 本课题主要结论如下：　　 1.本实验从兔外周血中成功分离、并在体外定向培养、扩增出具有典型特征的内皮祖细胞，与骨髓来源内皮祖细胞相比较，从自体外周血分离和培养内皮祖细胞，有取材方便，对机体损害小，细胞来源不受限制，无伦理方面的争论，且细胞纯度高的优点。　　 2.外周血来源内皮祖细胞自体移植能有效地保护油酸诱导的急性肺损伤，从而为内皮祖细胞自体移植治疗急性肺损伤提供新的策略。　　 3.自体内皮祖细胞移植能部份修复肺内皮功能，有效地减轻内毒素诱导的急性肺损伤，其保护机制可能与直接通过内皮细胞的修补作用和间接发挥旁分泌效应及抗氧化和抗炎效应，为进一步探讨内皮祖细胞对急性肺损伤的保护作用提供新的思路。　　 4．内皮祖细胞能成功转染hVEGF165基因，并在体外能促进内皮祖细胞的增殖、迁移和粘附能力，从而把转基因治疗和内皮祖细胞移植治疗结合起来提供新的方法。