心力衰竭是多数心血管病的最终归宿和主要死因。其症状复杂，预后严峻，是当今心血管疾病治疗中的一大难题，严重危害公共健康。强心苷（Cardiotonic steroid，Cs）是治疗心衰的传统经典药物，研究证明其治疗心衰的作用机制与钠钾泵（Na+/K+-ATPase，Na/K pump，NKA，钠泵）活性有关。钠钾泵是普遍存在于人类和动物细胞膜上的一种酶，其α亚基上存在强心苷的结合位点。目前认为强心苷治疗心衰的机制在于抑制心肌细胞膜上的钠钾泵，使细胞内Na+增加，通过Na+/Ca2+交换，引起胞浆Ca2+的升高，并促进肌浆网对钙的摄取及随后的钙释放（CICR），从而使心肌细胞的收缩力增强。但研究也发现，临床上强心苷有效治疗心衰的血清游离药物浓度（10-9-10-8M）比其抑制钠钾泵发挥离子转运功能的浓度要低得多，而且Gao等指出，低浓度强心苷（10-9-10-8M的双氢哇巴因）不但不抑制反而会兴奋钠钾泵。我室以往的实验也证实低浓度强心苷（10-10-10-8M的双氢哇巴因）能够产生兴奋性钠钾泵电流。这使得传统的钠钾泵抑制理论难以圆满解释治疗浓度强心苷的强心作用。因而，我们提出了低浓度强心苷可能通过直接兴奋钠钾泵而强心治疗心衰的假设，并首次在离体灌流豚鼠心脏发现nM为强心苷的治疗浓度，具有浓度依赖性持续强心作用和钠钾泵兴奋作用，且其强心作用与其兴奋钠钾泵作用呈显著正相关，首次为“强心苷兴奋钠钾泵可能为其强心机制”的假说提供了证据。但在分离的左心室内膜心肌细胞上虽也曾偶尔观察到此浓度强心苷的强心作用，却始终未得到稳定的测定结果。心肌细胞收缩舒张功能的测定对于心力衰竭的发生发展极其药物治疗机制的研究起着至关重要的作用。此类实验对细胞质量要求极高，不仅需要细胞能耐受持续刺激，而且要求细胞在一定时间内能维持稳定的收缩舒张功能。有文献报道，温度变化影响心肌细胞的收缩特性。本室以往实验中也发现，细胞的收缩力随着季节交替和温度变化而变化。因此，本实验拟首先以心肌细胞收缩功能为指标，通过连续升温和恒温孵育两种方法确定一个能使心肌细胞产生最大且最稳定收缩的最佳温度。并在此温度下测定低浓度(10-8M)OUA对大鼠心室肌细胞的正性肌力作用，观察钠钾泵各信号转导通路抑制剂对低浓度OUA正性肌力作用的影响。一、温度对大鼠心肌细胞收缩力的影响目的：确定一个能使心肌细胞产生最大且最稳定收缩的最佳温度。方法：用酶解法急性分离大鼠左室心肌细胞并覆钙，然后采用可视化单细胞动缘探测系统（Video-based motion edge-detection system）同步检测比较连续升温和固定恒温对单个大鼠心肌细胞舒张、收缩功能的影响。结果：1连续升温对心肌细胞收缩力的影响25℃—37℃逐步升温过程中，每个温度刺激下心肌细胞收缩力各不相同。若将25℃时（room temperature）大鼠心室肌细胞收缩幅度标准化为100%,则27℃、29℃、30℃、31℃使细胞收缩幅度分别增大至（107.694±2.042）%（p<0.01）、（127.0±6.3）%（p<0.01）、（142.5±17.0）%（p<0.05）、（139.0±17.7）%（p<0.05）；33℃、35℃、37℃时心室肌细胞收缩幅度分别为（130.4±18.3）%（p>0.05）、（132.5±25.6）%（p>0.05）、（129.8±33.3）%（p>0.05），与25℃时相比没有显著性差异。而且，30℃后随着温度的继续上升，细胞会出现不规律收缩，某些细胞还会出现形态改变，甚至挛缩死亡。以上结果提示，在25℃—37℃逐步升温过程中，温度为30℃时心肌细胞可达最佳收缩。2固定恒温对心肌细胞收缩力的影响25℃、30℃、35℃孵育1h后大鼠心室肌细胞收缩幅度有差异。25℃孵育的细胞收缩幅度为4.54±0.13，30℃孵育的细胞收缩幅度为6.92±0.33，35℃孵育的细胞收缩幅度为2.58±0.22，三组数据两两比较p<0.01。该结果表明：25℃、30℃、35℃三个温度恒温孵育后的细胞收缩幅度存在显著差异，其中30℃孵育的细胞收缩幅度最大且稳定，为25℃时收缩幅度的152%，此结果与连续升温时测定的结果一致，但增加比例较连续升温至30℃时的增加比例（142%）为大。与连续升温测定结果所不同的是，35℃时细胞收缩幅度最小，仅为25℃时收缩幅度的57%。结论：温度变化影响大鼠心室肌细胞的收缩舒张功能，30℃时细胞收缩力强且稳定，可能与低温升高细胞内钙和提高肌丝对钙的敏感性有关。二、低浓度OUA对大鼠心室肌细胞收缩力的影响及机制研究目的：观察低浓度(10-8M)OUA是否能增加大鼠心肌细胞收缩力，并研究与治疗浓度OUA发挥的正性肌力作用相关的钠钾泵信号转导通路。方法：（1）检测并比较10-9-10-4M浓度OUA增强大鼠心室肌细胞收缩力的作用。（2）先分别给予PP2（1μM）、NAC（10μM、100μM）、PD98059（10μM、50μM）、U73122（1μM）或Xestospongin C（1μM）5min，分别检测5种信号转导抑制剂对大鼠心室肌细胞收缩力的影响；之后继续分别用PP2（1μM）、NAC（10μM、100μM）、PD98059（10μM、50μM）、U73122（1μM）或Xestospongin C（1μM）与10-8M OUA共灌流，记录5种信号转导抑制剂对10-8M OUA增强大鼠心室肌细胞收缩力的影响。结果：1不同浓度OUA对大鼠心室肌细胞收缩力的作用10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，10-5M，10-4M的OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度分别增大至（111.973±3.885）%、（112.092±0.524）%、（123.045±2.199）%、（139.27±7.58）%、（179.46±36.323）%、(180.35±29.191)%，（p<0.01）。2信号转导抑制剂对10-8M OUA正性肌力作用的影响(1)1μM PP2（Src抑制剂）部分抑制10-8M OUA的正性肌力作用本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（114.16±1.776）%，（p<0.01）；灌流1μM PP2+10-8M OUA的收缩幅度为（102.527±6.415）%，（p>0.05）；而1μM PP2+10-8M OUA组与10-8M OUA组相比收缩幅度减小（p<0.05）。提示1μM PP2部分抑制了10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。(2)100μM NAC（ROS抑制剂）部分抑制10-8M OUA的正性肌力作用本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（114.246±2.16）%，（p<0.01）；灌流100μM NAC+10-8M OUA的收缩幅度变为（101.846±5.614）%，（p>0.05）;而100μM NAC+10-8M OUA组与10-8M OUA组相比收缩幅度减小（p<0.05）。提示100μM NAC部分抑制了10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。(3)1μM U73122（PLC抑制剂）部分抑制10-8M OUA的正性肌力作用本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（114.487±4.074）%，（p<0.01）；灌流1μM U73122+10-8M OUA的收缩幅度为（102.337±1.938）%，（p>0.05）。1μM U73122+10-8M OUA组与10-8M OUA组相比收缩幅度减小（p<0.05）。提示1μM U73122部分抑制了10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。(4)1μM Xestospongin C（IP3抑制剂）部分抑制10-8M OUA的正性肌力作用本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（111.516±7.201）%，（p<0.01）；灌流1μM Xestospongin C+10-8M OUA的收缩幅度为（99.07±10.404）%，（p>0.05）。1μM Xestospongin C+10-8M OUA组与10-8M OUA组相比收缩幅度减小（p<0.01）。提示1μM Xestospongin C部分抑制了10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。(5)10μM和50μM PD98059（MEK抑制剂）没有抑制10-8M OUA的正性肌力作用本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（113.366±2.128）%，（p<0.01）；灌流10μM PD98059+10-8M OUA使收缩幅度增大至（119.186±5.134）%，（p<0.01）；10μM PD98059+10-8M OUA与10-8MOUA组相比收缩幅度没有显著性差异（p>0.05）。提示10μM PD98059没有抑制10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。本组10-8M OUA使大鼠心室肌细胞收缩幅度增大至（114.246±2.167）%，（p<0.01）；50μM PD98059+10-8M OUA使收缩幅度增大至（121.707±5.762）%，（p<0.01）;50μM PD98059+10-8M OUA与10-8MOUA组相比收缩幅度没有显著性差异（p>0.05）。提示50μM PD98059没有抑制10-8M OUA的增加心肌细胞收缩力的效应。结论：10-9-10-4M的OUA均能增加大鼠心室肌细胞收缩性，且具有浓度依赖性。低浓度OUA的正性肌力作用与钠钾泵的信号转导功能有关，其中Src/EGFR/Ras/ROS信号途径和Src/EGFR/PLC/PIP2/IP3信号途径参与调节了10-8M的OUA的正性肌力作用，而Ras/Raf/MEK/ERK1/2cascade通路没有参与。