全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),约25％慢性乙肝患者最终将发展为肝硬化。肝硬化是一种严重威胁人类生命和健康的慢性疾病,如何有效的阻断、抑制或逆转肝硬化仍是当前临床治疗的重要难题。目前认为,机体免疫系统在肝硬化形成过程中扮演关键角色。免疫调节功能紊乱可能是肝硬化形成、进展的重要因为。更好的了解肝硬化患者的免疫状态,可能为乙型肝炎后肝硬化的干预治疗提供方向。　　 单核/巨噬细胞是机体内重要的固有免疫细胞,是机体免疫防御的第一道防线。肝硬化患者往往存在不同水平的内毒素血症,而内毒素是单核细胞活化、发挥效应功能的重要配体；研究发现,单核细胞接受刺激后可大量分泌TNF-α等炎性介质,可能进而介导肝脏纤维化的形成,特别是目前鉴定的一群CD14+CD16+单核细胞,有极强的炎性细胞因子分泌能力,被称为促炎症反应单核细胞。因此,单核细胞与肝硬化的病理生理过程密切相关,可能在肝脏炎症和纤维化的形成过程中扮演重要角色。　　 目前,对于肝硬化患者外周血单核细胞的特点和功能状态尚缺乏系统的报道。因此,通过研究肝硬化患者外周血单核细胞的表型、功能特点、与肝硬化患者不同的临床分期之间的关系,明确肝硬化患者外周血单核细胞的功能状态,为我们进一步了解肝硬化的形成机制、免疫病理状态及采取可能的干预措施提供理论依据。　　 目的:以健康人和慢性乙型肝炎患者作为对照,通过流式细胞术及胞内细胞因子染色方法阐述不同分期的肝硬化患者外周血单核细胞的表型特点和功能状态。　　 方法:　　 1.采用流式细胞术检测外周血单核细胞表型:随机选择肝硬化患者35例,其中代偿期肝硬化15人,失代偿期肝硬化20人。选择慢性乙型肝炎患者25例、健康组10例作为对照。抗凝采血管采外周血10ml,应用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,进行细胞计数后按染色方案分管,用CD14圈定单核细胞,检测其CD16,CD80及HLA—DR所占的百分比。　　 2.流式细胞术检测外周血单核细胞胞内细胞因子表达:分离出的单个核细胞分3组进行体外培养,分别加入LPS进行刺激,其终浓度为0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml。1小时后加入阻断剂Monensin,继续培养5小时。然后按照染色方案进行表面染色、破膜及胞内细胞因子染色,用流式细胞仪圈定CD14+单核细胞,检测TNFα,IL-10所占的百分比。　　 3.早期细胞凋亡的检测:分离的外周血单个核细胞体外培养24小时,用CD14、AnnexinⅤ-FITC和PI染色后,应用流式细胞仪检测CD14阳性细胞百分比中AnnexinⅤ阳性比例。　　 4.采用全自动生化仪检测ALT、ALB、GLB、TBIL等。采用自动血凝仪检测PT。彩色超声多普勒检测肝硬化患者腹水情况。根据患者症状及体格检查判断肝硬化患者有无肝性脑病,对存在肝性脑病患者进行分期。　　 结果:　　 1肝硬化患者外周血单核细胞的频率、表型及细胞因子表达特点:　　 1.1肝硬化患者外周血单核细胞的频率特点:检测的70例标本中,肝硬化患者35例,其中代偿期肝硬化15人,失代偿期肝硬化20人,慢性乙肝组25例,健康对照组10例。其中健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组CD14+单核细胞的频率分别为:(11.46±5.06)％,(11.94±4.72)％,(14.97±6.56)％,(22.89±8.98)％。其中健康对照组与慢性乙肝组及代偿期肝硬化组比较均无显著性差异(P>0.05),而健康对照组与失代偿期肝硬化组比较,代偿期肝硬化与失代偿期肝硬化组比较,均有统计学意义(P<0.05)。　　 1.2肝硬化患者外周血CD14+CD16+单核细胞的频率:健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组CD16+CD14+单核细胞占CD14+阳性单核细胞的比例分别为:(4.56±2.74)％,(6.18±3.95)％,(8.68±2.78)％,(14.61±6.61)％。其中健康对照组与慢性乙肝组比较无显著性差异(P>0.05)。而健康对照组与代偿期肝硬化组、失代偿期肝硬化组比较,代偿期肝硬化与失代偿期肝硬化组比较,均有统计学意义(P<0.05)。　　 1.3肝硬化患者外周血单核细胞HLA-DR的表达水平:健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组的单核细胞HLA-DR的表达分别为:(83.59±11.19)％,(83.87±10.78)％,(70.21±11.58)％,(55.92±11.55)％。其中健康对照组与慢性乙肝组比较无统计学意义(P>0.05)。而与健康对照组相比,代偿期肝硬化组、失代偿期肝硬化组HLA-DR的表达水平均明显降低,组间比较均有统计学意义(P<0.05),而代偿期肝硬化与失代偿期肝硬化组比较没有统计学意义(P>0.05)。　　 1.4肝硬化患者外周血单核细胞CD80的表达水平:健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组单核细胞CD80的表达分别为:(5.98±3.38)％,(5.59±3.10)％,(5.78±2.51)％,(6.44±2.17)％。四组之间两两比较均无统计学意义(P>0.05)。　　 1.5肝硬化患者外周血单核细胞分泌TNF-α的能力:健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组单核细胞分泌TNF-α的水平分别为:(39.28±12.26)％,(35.88±10.93)％,(41.53±13.05)％,(57.85±11.73)％。其中健康对照组与慢性乙肝组及代偿期肝硬化组比较均无统计学意义(P>0.05),而健康对照组与失代偿期肝硬化组比较,代偿期肝硬化与失代偿期肝硬化组比较,均有统计学意义(P<0.05)。　　 1.6肝硬化患者外周血单核细胞分泌IL-10的能力:健康对照组、慢性乙肝组、代偿期肝硬化组及失代偿期肝硬化组的单核细胞分泌IL-10的水平分别为:(2.21±2.26)％,(2.43±1.99)％,(2.13±1.11)％,(2.34±2.14)％。四组之间两两比较均无统计学意义(P>0.05)(Fig.7)。　　 1.7肝硬化患者外周血单核细胞早期凋亡的检测:分别检测16例标本中,健康对照组7例,失代偿期肝硬化组9例。两组中膜联蛋白Ⅴ阳性的单核细胞频率分别为:(4.77±3.50)％,(15.02±8.09)％。组间比较具有统计学意义(P<0.05)。　　 2肝硬化患者外周血单核细胞功能试验:　　 三组不同浓度的LPS刺激后CD14+单核细胞所分泌的TNF-α及IL-10的能力:检测16例标本中,其中健康对照组8例,失代偿期肝硬化组8例,分别应用三组不同浓度LPS刺激后,检测TNF-α,IL-10的水平。结果显示,健康对照组CD14+单核细胞分泌TNF-α、IL-10的水平随着刺激浓度的增加而明显升高,而失代偿期肝硬化组TNF-α、IL-10的水平则随着LPS浓度的增加升高不明显。　　 结论:肝硬化患者外周血单核细胞及其亚型(CD14+CD16+单核细胞)频率均增加,HLA—DR表达水平降低,产生促炎细胞因子TNF—α增加。且应用不同浓度的LPS刺激,刺激剂的浓度增加却不能引起它们的生物活性升高。肝硬化患者病情越重,肝脏储备功能越差,则单核细胞及CD14+CD16+单核细胞频率越高,活化程度越低,同时产生的促炎因子水平越高。其频率及生物学功能与病情的严重性有密切关系,动态观察这些细胞及产生的细胞因子水平对于肝硬化的转归及预后具有较重要的意义。