组织工程是一门正在迅速发展的学科,它的目标是结合细胞、生物材料和生物活性分子来制造、修复甚至替代组织和器官。心肌组织工程是组织工程研究领域的热点之一。近年来,心肌组织工程研究发展迅速,要保证工程化心肌组织在体内移植后存活并发挥功能,及时充分的血液供应起着重要作用。在组织工程化心肌血管化研究方面常使用的方法有:细胞支架材料复合体中添加促血管生长因子、心肌细胞支架材料复合体中添加内皮细胞、将复合体移植到体内血运丰富的部位来促进其血管化等。血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞,到目前为止,通过在心肌细胞和支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。本研究首先尝试分离培养人脐静脉来源的内皮细胞,并与细胞外基质凝胶混合制备组织工程化内皮片层,探索内皮细胞能否在细胞外基质凝胶中存活,并形成一定结构;然后以细胞外基质凝胶为支架,以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,体外构建适用于临床修复治疗用的组织工程化心肌片层;最后以新生大鼠心室肌细胞与人脐静脉内皮细胞为种子细胞,以细胞外基质凝胶为支架材料,并施以静态拉伸,混合构建组织工程化血管化心肌片层。观察内皮细胞和心肌细胞之间相互作用的关系,并进行初步的组织学鉴定与超微结构观察,对组织工程化心肌片层的血管化进行初步探索性研究。本实验尝试以细胞外基质凝胶为支架加入人脐带来源的内皮细胞构建组织工程化心肌片层,并施以静态拉伸力,不但可以使构建的组织工程化心肌片层更为稳定,同时也可以使再造的组织体外维持一定的张力,增强了再造组织的致密性和质量,以期使组织工程化心肌能够在移植后快速的血管化,提高细胞存活率,更好的应用于临床,相关研究未见报道。通过上述研究,我们发现在三维培养模型中,人脐静脉来源的内皮细胞在支架中生长状态良好,随着体外培养时间的延长,支架材料内的血管内皮细胞逐渐聚集并形成条索样的血管组织,采用新生大鼠心室肌细胞与细胞外基质凝胶复合方式可以在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有心肌组织类似的结构和特性。在三维共培养模型中,可观察到心肌细胞在支架内活力良好(包括跳动强度,活细胞数量、死细胞数量、心肌形成质量、收缩频率、细胞凋亡率),通过细胞凋亡检测发现支架内心肌细胞凋亡少,明显优于单纯心肌细胞组(P＜0.05,t检验)。随着体外培养时间的延长,支架材料内的心肌细胞逐渐聚集并发育成心肌组织,心肌组织质量优于单纯心肌培养组。电镜观察可见明显的横纹结构,以及心肌组织的特征性的超微结构,如T小管,闰盘等。与单纯心肌细胞组相比,在形成的心肌组织中,随着时间的延长,可见更为明显的条索样微血管网络结构的形成,至21天检测发现微血管网络范围、密度加大,并可见口径较大的管腔结构样的小血管形成。本研究是在液态胶原中对心肌组织工程血管化研究的首次尝试。具体研究内容如下:第一部分:分离培养人脐静脉来源的内皮细胞,并与细胞外基质凝胶混合制备组织工程化内皮片层。第二部分:以新生大鼠心室肌细胞为种子细胞,与细胞外基质凝胶混合构建工程化心肌组织片层。第三部分:以新生大鼠心室肌细胞与人脐静脉内皮细胞为种子细胞,以细胞外基质凝胶为支架材料,并施以静态拉伸,混合构建组织工程化血管化心肌片层。