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家兔肠炎是养兔业中危害最严重的消化道代谢疾病。根据肠炎病因的来源,可以将肠炎分为已知病原体的肠炎(肠炎)和未知病因的肠炎(非特异性肠炎)两大类。目前普遍认为肠炎的发生主要与遗传、免疫、环境等因素有关,然而相关发病机制尚不清楚,有待深入深究。JAKs-STATs信号通路广泛参与机体细胞的增殖、分化、存活、凋亡,介导机体免疫调控和肿瘤发生等生命活动过程,且有报道指出IL-23R-JAKs-STAT3信号通路与人类的炎症性肠病(IBD)相关。因此,本试验期望从JAKs和STATs两大基因家族中,找到与家兔肠炎相关基因的cSNP,并探讨JAKs-STAT3信号通路在家兔肠炎发病过程中的分子作用机制。本试验采用case-control实验设计,以480只新西兰兔(case 253只,control 227只)为试验对象,筛查JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3和STAT5a基因的cSNP,并进行JAK1, STAT3基因与肠炎易感性的关联性分析；在低纤维日粮诱导家兔肠炎群体中(60只),检测JAK1, STAT3基因在回肠、结肠组织中的mRNA表达水平；通过培养家兔原代小肠上皮细胞(IEC)并用LPS构建家兔IEC炎症细胞模型；在炎症细胞模型中筛选有效下调JAKs(JAK1, JAK2和TYK2)基因表达水平的高效siRNA分子和Western blot检测STAT3蛋白表达水平,并利用RAN-Seq技术对转染si-JAK1的IEC炎症细胞模型组及对照组进行转录本的测序验证,分析JAKs-STAT3在家兔肠炎发病中的不同作用。获得以下主要结果：1. 利用PCR产物纯化后直接测序法,筛查新西兰兔JAKs和STATs两个家族六个基因的编码区cSNP,共发现22个cSNP,分别是JAK1 3个,JAK21个,TYK25个,STAT15个,STAT3 4个和STAT5 α4个。其中,JAK1 c.1421 C>T和TYK2c.1477 C>T是非同义突变,分别导致氨基酸p.Thr 474 Met (T>M)和p.Leu 404 Phe (L>F)的改变,其余的cSNP均为同义突变。通过非同义突变导致氨基酸损害程度分析和同义突变密码子偏好性分析,选择JAK1 c.1421, c.3036和STAT3 c.399, c.831四个cSNP进行家兔肠炎case-control关联性分析,结果发现JAK1等位基因C(c.1421)和A(c.3036)分别是风险等位基因和保护等位基因；STAT3等位基因C(c.831)和G(c.399)分别是风险等位基因和保护等位基因。运用多因子降维法(MDR)分析JAK1(c.1421 C>T、 c.3036 A>G)和STAT3 (c.399 G>A、c.831 T>C)基因的遗传交互作用,结果发现四个cSNP组成8个遗传交互作用模型,其中7个模型对家兔肠炎的易感性存在交互作用,模型(命名:c1421,c3036, c831)显著地与家兔肠炎易感性相关(OR:2.7262; 95% CI:4.7408-5.1986; P<0.0001)。2. 在低纤维日粮诱导试验的家兔群体中,荧光定量PCR(qPCR)试验分析发现JAK1 (c.1421 C>T)基因在回肠和结肠中的严重组表达量最高,分别为0.2398±0.0145 和 0.1835±0.0175。JAK1基因在严重组回肠中的表达量极显著高于健康组(P=0.0056),显著高于轻微炎症组(P=0.039)。在回肠中CC基因型的表达量与CT和TT基因型表达量的差异分别达到显著水平(P=0.031)和极显著水平(P=0.0082)；在结肠中只有CC基因型与TT基因型的mRNA表达量呈现显著相关(P=0.026)。STAT3(c.399 G>A)基因在回肠和结肠中的严重组表达量最高,分别为0.3598±0.0249和0.2881±0.0671。STAT3基因在严重组回肠中的表达量极显著高于健康组(P=.0089),显著高于轻微炎症组(P=0.013),健康组和轻微组相互之间差异也达到显著水平(P=0.045)。在回肠中AA基因型的表达量与GG基因型表达量的差异达到极显著水平(P=0.0012)；在结肠中AA基因型与AG、GG基因型的mRNA表达量均呈现显著相关(P=0.036,P=0.029),而AG和GG基因型之间的mRNA表达水平差异不显著(P=0.219)。3.采用胶原酶I (0.2 mg/ml)成功分离培养家兔原代IEC,运用相差消化法及相差贴壁法纯化IEC,经CK-18单克隆抗体鉴定其纯度达95%以上。纯化后的IEC培养体系中添加终浓度为1000 ng/ml的LPS并作用24 h,再利用ABC-ELISA法检测到LPS模型组中IL-1β、TNF-α两个经典的急性炎症早期细胞因子含量均显著高于同时段对照组(P<0.01),结果表明LPS诱导兔IEC炎症细胞模型构建成功。4.利用阳性对照si-Pcontrol-GAPDH和荧光Cy3标记的阴性对照si-Ncontrol 05815确定了最佳脂质体转染体系,获得能够有效下调JAK1,JAK2和TYK2基因表达的siRNA分子(si-JAK1-001, si-JAK2-001和si-TYK2-003)。通过调整siRNA转染的终浓度,使其沉默靶基因的效率基本一致(70%),通过qPCR检测STAT3基因在已转染高效siRNA的炎症细胞模型中mRNA表达水平,以及利用Westeren blot分析p-STAT3(Tyr 705)和STAT3,总蛋白的表达量,结果发现JAK1、JAK2、 TYK2分别下调STAT3基因的mRNA表达水平为76.34%、23.89%和42.14%,分别下调p-STAT3表达水平0.71%,0.24%和0.35%,而总蛋白水平却没有明显变化,表明JAK1是导致STAT3 (Tyr 705)位磷酸化的主因。5. 通过RNA-Seq技术对转染si-JAKl-001的IEC炎症细胞模型和对照组的测序,结果发现采用RNA fragmentation策略构建测序文库可以获得良好的测序随机性和较高质量的测序数据,与参考基因比对率约为40.05%,并且大约65%基因的Coverage达到90-100%。RNA-Seq基因差异表达分析发现两组重复试验有491个上调基因,780个下调基因,涉及到压力应答,类固醇激素刺激应答以及免疫系统发育等生物学过程。RNA-Seq进一步证实si-JAK1-001可以有效沉默JAK1基因。Pathway显著性富集分析揭示JAKs-STATs信号通路中相关基因的功能与家兔IEC炎症细胞模型的免疫应答相关,且JAK1选择性显著下凋STAT1、STAT3、STAT5b基因的表达水平。本研究着重揭示JAK1和STAT3基因与家兔肠炎易感性的关系；阐述JAK1是激活STAT3(Tyr705)位磷酸化的主因,从而加剧家兔肠炎的发生,为家兔肠炎的分子抗病育种和JAKs、STATs激酶抑制剂的研发提供理论依据。